文档介绍：紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
定义:紫外可见分光光度法:根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围(150~800纳米)单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法;
分子荧光光度法:利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质,对物质定性或定量分析的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。
组成部件:紫外可见分光光度法:①辐射源。必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱,如钨灯、卤钨灯(波长范围350~2500纳米) ,氘灯或氢灯(180~460纳米),或可调谐染料激光光源等。②单色器。它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件(棱镜或光栅)组成,是用以产生高纯度单色光束的装置,其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。③试样容器,又称吸收池。供盛放试液进行吸光度测量之用,分为石英池和玻璃池两种,前者适用于紫外到可见区,后者只适用于可见区。容器的光程一般为 ~10厘米。④检测器, 又称光电转换器。常用的有光电管或光电倍增管。。⑤显示装置。这部分装置发展较快。较高级的光度计,常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等,可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
分子荧光光度法:激发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。1. 光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。常用的有溴钨灯、高压***灯、氙灯。2. 单色器,两个单色器。3. 样品池通常用石英制成。4. 检测器:光电倍增管。
常见类型:紫外可见分光光度法:。简单,价廉,适于在给定波长处测量吸光度或透光度,一般不能作全波段光谱扫描,要求光源和检测器具有很高的稳定性。 ,快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响,特别适合于结构分析。仪器复杂,价格较高。。将不同波长的两束单色光(λ1、λ2) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△l=1~2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。
分子荧光光度法:1. 光电荧光计用滤光片作单色器(激发滤光片和荧光光片),溴钨灯或高压***灯作光源,光电管为检测器。2. 荧光分光光度计用氙灯作光源、光栅作单色器,光电倍增管为检测器。可连续扫描激发光谱和荧光光谱。
原理: 紫外可见分光光度法:紫外- 可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。最大吸收波长(λmax)表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收,它与分子中外层电子或价电子的结构( 或成键、非键和反键电子)有关。朗伯-比尔定律是分光光度法和比色法的基础。这个定律表示:当一束具有I0强度的单色辐射照射到吸收层厚度为b,浓度为c的吸光物质时,辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层的厚度。其数学表达式为: 式中的A叫做吸光度;I0为入射辐射强度;I为透过吸收层的辐射强度;(I/I0)称紫藤为透射率T;ε是一个常数,叫做摩尔吸光系数,ε值愈大,分光光度法测定的灵敏度愈高。
分子荧光光度法:分子吸收能量后,从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级(这一过程速度很快,大约10-15 s),成为激发单重态分子。激发态分子不稳定,可以通过以下几种途径释放能量返回基态。1. 振动驰豫。这一过程只能发生在同一电子能级内,即