文档介绍：基因工程的基本过程
基因工程主要包括几个过程:
1、目的基因的制备;
2、选择合适的载体,将目的基因与载体相连接生成重组DNA分子;
3、将重组DNA片段导入受体;
4、选择目的基因;
5、目的基因的表达。
对于整个基因过程来讲,目的基因的获取是关键,它直接涉及到产物,而且还影响到产物的量。很多在基因操作过程中,目的基因是很难获得的,所以通常采取先生成基因文库的方法,然后从基因文库中筛选。如果目的基因的序列以及它的调控等信息很清楚,可以直接通过PCR或cDNA获取,这样就大大减少了选择目的基因的盲目性,可以将整个过程简化为以下步骤:
图10-3-8 基因工程过程
(1)目的基因的分离和制备
目的基因是指准备导入受体细胞内的,以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。获得目的基因的方法很多,但也是十分困难的一步。目前获得目的基因有4条途径:
    原核生物基因组较小,基因容易定位,用限制性内切酶将基因组切成若干段后,用带有标记的核酸探针,从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。
图10-3-1 限制性内切酶
限制性内切酶(restrictive enzyme)是20世纪60年代末在细菌中发现的,能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键,使一个完整的DNA分子切成若干段,每一种限制酶,都有自己特定的作用位点,而且切口或切下来的序列,往往是回文结构(palindromes)。例如Eco RI把GAATTC在GA之间切开,形成粘性末端。也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端,如HapI。多在原核生物中存在,能识别4~6个特苷酸特定的碱基序列。限制酶对细菌有保护作用,某些入侵的噬菌体可因DNA链被限制性酶切断而不能在细菌中繁殖,“限制”因此而得名。限制酶不能切开细菌本身的DNA,这是因为细菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化(-CH3)而受到保护之故。
这样就可以用限制性内切酶把一个基因组DNA分成很多片段,对于原核生物比较小的基因组来说,可以直接用标记地探针来获取在通过特定的方法,对于比较大的基因组,可以先制作基因文库,然后钓取所需要的带有目的基因的片段。
    人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。
    聚合酶链式反应(PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多,但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解,需要设计引物。PCR技术的原理如下:
图10-3-2 PCR原理图
(1)以混合的 DNA 片段作模板,例如,可以用 cDNA 基因文库做模板,在 90℃高温下,作为模板的双链 DNA 均变性,分开成为单链DNA。
(2)在反应体系中以有两种合成的 DNA 小段寡聚核苷酸做引物,这两种寡核苷酸应可以分别和特异 DNA 片段的正链的 3'末端与负链的 3'末端相结合。寡核苷酸引物要在 50℃的温度下,才能较好的找到可以配对的正链和负链,形成互补结合。显然,在混合 DNA 片段作模板的情况下,只有可以形成配对关系的 DNA 链才可特异性地结合引物寡核苷酸。这个过程又称为淬火。
(3)反应体系中还有高温 DNA 聚合酶,以及作为原材料的四种脱氧核苷三磷酸(4 X dNTP) 。高温 DNA 聚合酶来自一种特殊的耐高温细菌,俗称 Taq 酶。在 70℃高温下,经 Taq 酶催化,以四种脱氧核苷三磷酸为原料,在形成互补的引物寡核苷酸后,迅速合成一条与模板 DNA 单链(正链或负链)互补结合的DNA新链。
(4)以上三个步骤周而复始,即反应体系的温度从 90oC- 50oC- 75oC,反应体系中经历:变性( DNA 双链变性生成单链)——淬火(寡核酸引物和特异的 DNA 模板结合,配对)——合成(以引物为起点,合成与模板互补的 DNA 新链)。每次循环约需6-10分钟。经过20次循环,能与引物特异结合的那段 DNA ——即需要放大增殖目的
DNA 分子,可以扩增106倍。
    mRNA差异显示(mRNA differential display, DD)是1992年由哈佛医学院Peng Liang等人建立的。原理是先用PCR技术扩增所有的mRNA、生成cDNA群体,再用测序凝胶电泳获取所需要的目的基因,然后再次用PCR扩增。简单的讲,就是从基因的转录产物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因。
5、用机械的方法,例如超声波把基因组打成片段。
(2)DNA片段