12免疫学检测.ppt

文档介绍：免疫学检测原理
细胞:各类免疫细胞膜表面表达的标志和功能;细胞亚群的数量和功能
分子:各类Ig、C、CK、CKR、AM表达水平和活性。
相关基因:表达与调控、遗传多态性、基因分型。
免疫细胞的检测
一、免疫细胞的分离与纯化
外周血单个核细胞的分离(F-H密度梯度离心)
原理:
的分层液,将肝素抗凝
全血叠加在分层液上,
离心后形成不同层次液
体和细胞区带,分离除
PBMC.
密度梯度离心分离淋巴细胞亚群
淋巴细胞的纯化与亚群的分离
1、淋巴细胞:经淋巴细胞分层液分离的PBMC用黏附法去出单核细胞
2、淋巴细胞亚群的分离
E花环
尼龙棉柱法
FCM:
MACS:
3、小鼠可从脾脏获得单个核细胞、从腹腔获得巨噬细胞
淋巴细胞及其亚群检测
免疫组织化学(检测T细胞及亚群,AM)
免疫细胞的功能
T细胞增殖实验
原理:活细胞的线粒体作用于MTT,可生成兰黑色甲赞产物,其生成的量与细胞代谢活性呈正比。
* 以10%FCS-1640培养基将PBMC浓度调至2105/ml,加至酶标孔中,100ul/孔,并加入一定浓度的PHA.
* 培养96h;
* 弃上清,加入MTT(5mg/ml),10ul/孔;
* 继续培养2-4h;
* 加入DMSO 100ul/孔,混匀;
* 酶标仪测定各孔的OD值。
NK细胞活性检测
效应细胞靶细胞释放LDH
***酸
乳酸
乳酸脱氢酶(LDH)
NAD+
NADH+H+
PMS
NBT
甲替(OD570nm)
NK细胞活性测定
效应细胞的制备(分离外周血单个核细胞)
靶细胞的制备
效-靶细胞相互作用
酶促反应
结果判读