文档介绍：实验五 (ELISA)
(ELISA)
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免疫标记技术
定义:
将抗原-抗体反应与标记技术相结合,用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原,通过检测标记物,间接测定未知的抗原或抗体。
分类:
放射免疫测定法:131I,32P
免疫荧光技术:FITC,PE
免疫酶测定法:HRP,AP
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免疫酶测定法 (Enzyme ImmunoAssay,EIA)
用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶(AP)
特点:
高度特异性:保持抗原抗体反应的特异性
高灵敏度:酶催化底物显色的高效性,pg水平微量检测
定性定量检测:反应液颜色深浅或光密度值
分类:
酶联免疫吸附试验:可溶性抗原或抗体
酶免疫组化法: 组织中或细胞表面的抗原。
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酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
用酶标记抗原或抗体检测液体(血液、细胞液)中未知抗体或抗原的方法。
间接法(Indirect ELISA):
将已知抗原吸附于固相载体,酶标记二抗
检测液相中未知抗体
双抗体夹心法(Sandwich ELISA):
将已知抗体吸附于固相载体,酶标记一抗
检测液相中的可溶性抗原
petitive ELISA) :
将已知抗体或抗原吸附于固相载体,酶标记抗原或抗体
检测液相中的可溶性抗原或抗体
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酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
3. 原理(以间接性ELISA为例):
显色
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实验内容: 间接法测定溶血素——定性检测
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实验材料
脱纤维绵羊红细胞——抗原
兔抗绵羊红细胞抗体(溶血素)——待测兔血清
HRP标记羊抗兔IgG ——二抗
包被缓冲液:
洗涤液:% Tween PBS
底物缓冲液:
底物溶液:OPD 10mg,底物缓冲液25ml,30% H2O2 40μL
酶标板,酶标仪
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实验方法
:
脱纤维绵羊血
加3mL ,混匀
2000rpm,5min
加3mL ,混匀
2000rpm,5min
取2mL压积红细胞
加入2mL蒸馏水,震荡破碎红细胞
用包被缓冲液稀释成1:400备用
:
取酶标板,加入100μL/孔的抗原稀释液
4℃,湿盒内,18h
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取出包被好抗原的酶标板(4孔/组),甩干孔内液体
以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3min/次
标记各孔,加入相应液体100μL/孔
1
2
3
4
阴性
空白
阳性
待测
:
37℃,湿盒内,30min
甩干孔内液体
以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3min/次
各孔加入酶标二抗100μL/孔
37℃,湿盒内,30min
:
甩干孔内液体
以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3min/次
加入底物溶液100μL/孔
避光显色,10min
实验方法
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