文档介绍：乳液 PCR 法扩增复杂基因序列方法的建立
生物化工与环境工程学院
学生:徐敏轩
指导教师:张红琳周东蕊
研究背景、目的与意义
目的
建立乳液PCR(ePCR)方法,解决普通PCR(cPCR)方法的瓶颈问题
乳液PCR
普通PCR
背景
PCR技术作为一种特异性DNA体外扩增技术,具有实践证明了的诸多优点,但普通PCR在一定方面存在偏向性,实验方法依然有待进一步完善
意义
通过建立乳液PCR(ePCR)方法解决普通PCR存在的问题,为体外扩增特异性DNA提供了新的实验方案,弥补了国内空白
普通 PCR 方法的优越性与局限性
cPCR
操作
简便
快速
用时少
经济
价格低廉
样本DNA
数量少
灵敏
度高
重复
性好
特异
性强
样品处理简单
乳液 PCR 方法与普通 PCR 方法的基本原理比较
Droplets in Oil
ePCR
AP
Oil
AP
Oil
T
Min
cPCR
Oil
Oil
Oil
3步PCR
Oil
仪器与试剂
磁棒(3×8mm)
旋涡振荡器(1700rpm)
低温冷冻管( ml)
主要仪器
凝胶成像系统Syngene
GS-800灰度扫描仪
水平电泳仪PAC3000
主要试剂
***(水饱和)
小牛血清白蛋白(BSA)
Mineral oil
Tween 80
Span 80
人工乳酸菌质粒
Forward primer
Reverse primer
Triton X-100
Oil
PCR buffer
dNTPs
DNA polymerase
Mg2+
ddWater
cPCR
ePCR
实验方法与步骤
乳液PCR油相制备
乳液PCR和普通PCR水相制备
乳液制备
PCR扩增
水饱和***制备
破乳
扩增产物检测
实验
准备
部分
实验
实施
部分
样品配比
1
2
7
3
4
6
5
实验结果
1 乳液PCR油相制备
50ml离心管,在25oC条件下表1配制(2份油相)
移取750μl油相
375μl
375μl
1700rpm持续搅拌
2 乳液PCR和普通PCR水相制备
,25oC条件下表2配制
(每个样品3个平行+1空白)
3 乳液 PCR 乳液制备
OIL 50ml
乳液PCR AP 300ul
750ul
375ul
375ul
150ul(含BSA)
150ul(不含BSA)
水油体积比 1:
含BSA乳液
不含BSA乳液
水相逐滴加入
2min内加完1700rpm,5min