文档介绍：深究体外培养人牙周膜细胞方法
摘要:目的:研究如何提高体外培养人牙周膜细胞的成功率,为简便、快速地获得大量成活率高的hPDL膜细胞,建立体外细胞模型提供一定的实验方法。方法:利用3种不同方法进行牙周膜细胞的原代培养,用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源;通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果:3种方法获得的细胞形态和生物学行为大致相同;波丝蛋白抗体染色阳性,角蛋白抗体染色阴性。组织块法培养的细胞同源性好,但初代培养时间长;全牙消化法的原代培养成功率高于其他2种方法。结论:通过对牙周膜细胞培养方法的改良,可以显著提高hPDL原代培养的成功率。
关键词:牙周膜细胞培养免疫组织化学
细胞体外分离培养是研究复杂的生物系统的重要手段,细胞培养条件下,将细胞从复杂的体内环境转移到较为简单的体外环境,可对细胞学研究中的变量进行分离和控制。上世纪70年代以来,国外学者对牙周膜细胞分离纯化进行了大量的探索和研究,且成功地从猴、猪、人等牙周膜分离培养出牙周膜细胞[1~3]。人牙周膜细胞分离培养主要有酶消化法和组织贴块法[4]。国内外学者对这2种方法评价不一,并且在这2种方法的基础上进行改进提出了酶消化组织块法和全牙消化法[5]。对组织块法、酶消化组织块法和全牙消化法这3种方法做了一些比较,以寻求hPDL体外培养的最佳方法。
1、材料和方法
试剂及主要实验仪器设备
α-MEM培养液,胶原酶,胎牛血清,胰蛋白酶,青霉素100U/ml,链霉素100mg/L;SABC免疫组织化学试剂盒,角蛋白抗体及波丝蛋白抗体,二氧化碳恒温培养箱,倒置相差显微镜,血球计数板。
方法
组织块法培养hPDL
取材:选择健康青少年正畸拔除的健康的双尖牙,超净工作台内用刀片仔细刮除附着牙龈及根尖组织,用D-Hanks液冲洗3次;无菌处理:将牙冠浸入%次***酸钠溶液中2min,再用含高浓度双抗的D-Haks液冲洗2遍。按照司徒镇强[6]传统组织块培养法进行原代培养;传代:细胞汇合至培养瓶80%时,用%的胰蛋白酶消化液1∶2消化传代。
酶消化组织块法培养hPDL
酶消化组织块法原代培养在取材、无菌处理上与组织块法相同。刮下根中2/3的牙周膜后,不剪,移入离心管内。%胶原酶37℃消化30min,其中,每5min振荡1次,当肉眼观察到培养液略混浊,显微镜下见组织块松散时,离心,弃上清液,用含血清及双抗的培养基漂洗1次后弃上清液,收集组织块,将组织块平铺于培养瓶底,翻转培养瓶,向内加入4ml培养液,置CO2培养箱孵育2h,使组织块贴壁,再翻转培养瓶培养;传代与组织块法相同。
全牙消化法培养hPDL
全牙消化法原代培养牙周膜细胞取材、无菌处理与组织块法相同。将牙齿放入装有%胶原酶的青霉素小瓶内,牙根向下,使消化液浸没牙根,37℃温箱内消化1h,用吸管充分吹打牙根表面,加入等量含血清的培养基,离心,弃上清液,加入3ml培养基吹打形成细胞悬液,移入25ml培养瓶内,置CO2培养箱内进行培养,3d换液1次,待细胞铺至瓶底80%时用%胰蛋白酶1∶2消化传代。
细胞的生长情况观察
倒置相差显微镜连续观察细胞原代和传代生长情况。
染色
取生长状态良好的第5代细胞进行爬片,用苏木精-伊红染色,观察细胞形态。
细胞免疫化学染色
将培养的第3代