文档介绍：2)4%多聚甲醛配制
取 40g 多聚甲醛粉末,加入 PBS(PH=-)900ml,加热至 60℃,在搅拌的同时滴加 1M NaOH 使溶液澄清,用 ddH2O 定容至 1000ml,用滤纸过滤即可,4℃保存。
3)二氨基联苯***(DAB)显色试剂盒
为过氧化物酶的显色剂之一。含有 A、B、C 三种显色试剂。临用时取蒸馏水 1 毫升加试剂 A、B、C 各一滴混匀即可。现用现配。 4)30%丙烯酰***凝胶储存液:将 29g 丙烯酰***和 1g N,N’-亚***丙烯酰***溶
于总体积为 60 ml 的 ddH2O 中,加热至 37℃溶解,补加 ddH2O 至终体积为 100 ml。 微孔滤膜过滤除菌,检测该溶液 pH 值应不大于 ,置棕色瓶内在 4℃中避光保存备用。
5)10%过硫酸铵 AP:提供驱动丙烯酰***和 N,N’-亚***丙烯酰***聚合所必需的自由基。取 AP ,加入去离子水 5ml 中搅拌溶解,分装成 1ml/管,-20℃中保存,即用即取,解冻后置于 4℃中保存,短期内使用。
6)10%SDS:SDS 10g,加入去离子水 100 ml,在 37℃水浴中搅拌助溶,置于室温下保存备用。
7) mol/l Tris-盐酸():在 300 ml ddH2O 中溶解 91 gTris 碱(), 用 1 mol/l HCl 调节 pH 至 ,补加 ddH2O 至体积 500 ml,置于 4°C 中保存备
用。
8)1 mol/l Tris-盐酸():在 40 ml ddH2O 中溶解 gTris 碱,用 1 mol/l HCl 调节 pH 至 ,补加 ddH2O 至体积 100 ml,置于 4°C 中保存备用。
9)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液储存液:Tris 、甘氨酸 94g、,加
入去离子水 800ml,搅拌溶解,定容至 1L,置于室温下保存备用。 10)膜转移缓冲液:甘氨酸 、Tris 、SDS ,加入去离子水约 600ml, 充分搅拌溶解,定容至 800 ml,置于室温下保存备用。临用前加入甲醇 200 ml。 11)10×TBS:***化钠 40g、Tris ,加去离子水溶解,定容至 500 ml,加浓盐酸调节 pH 至 ,置于 4°C 中保存备用。
12)1×TBST:10×TBS 50 ml,加去离子水定容至 500 ml,加 Tween-20 ml,
置于 4°C 中保存备用。
13)封闭液(5%脱脂奶粉):5g 脱脂奶粉加 1×TBST 至 100ml,充分搅拌溶解, 滤纸过滤,现配现用。
2 方法
实验动物及分组
选择健康雄性清洁级 SD 大鼠 72 只,体重(200±10)克。随机分为 4 组:①假手术组(A 组),②UUO 模型组(B 组),③UUO 加冬虫夏草治疗组(C 组),④ UUO 加冬虫夏草和血红素加氧酶抑制剂卟啉锌(zinc(a)protoporphyrin η,ZnPP)治疗组(D 组)。
注:各组年龄、性别、体重各方面匹配,各组均 18 只。
实验方法
UUO 模型制作及取材
各组大鼠以 2%戊巴比妥钠按 40 mg/kg 腹腔注射麻醉后,将其固定于手术台上,去毛备皮并消毒腹部皮肤,行左侧腹部切口,逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层,沿左肾下极寻找到左输尿管,暴露并分离左侧输尿管,其中假手术组大鼠仅切开腹腔并游离左侧输尿管,但不予结扎和剪断,其他各组大鼠于输尿管中上 1/3 处用 4 号线上下结扎两处,然后在两道丝线结扎点间剪断输尿管,并逐层缝合。术后继续灌胃,方法同上,各组大鼠随机选取 6 只分别于输尿管结扎术后第 3、7、14 天断头处死,快速取出左肾,去掉包膜,按冠状位纵形剖开, 取肾组织的 1/2 置于 4%多聚甲醛固定液固定,另外 1/2 置于液氮中保存。
肾组织病理学检查(HE 染色和 Masson 染色)
①石蜡切片制作 1)组织固定、脱水、浸蜡、包埋:
组织块约为 7×5×2mm,置于 4%多聚甲醛中,固定 24 小时后,于 75%乙醇脱水 30 分钟两次、95%乙醇脱水 20 分钟两次、无水乙醇脱水 10 分钟。二
甲苯脱乙醇 3 次,各 30 分钟。石蜡浸入 3 次,分别为 30 分钟、30 分钟、
1 小时。石蜡冷却包埋。
2)载玻片的处理:
将载玻片放入硫酸洗液浸泡 24 小时以上,用流水冲洗干净硫酸洗液,95%
乙醇浸泡 24 小时左右,蒸馏水洗 5 次,将载玻片整齐排好,放入烤箱中烤
干。将洗净、干燥的玻片放入