文档介绍：大肠杆菌感受态细胞的 制备及转化
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
一、实验原理
目前,感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制
备,即用低渗CaCl2溶液在低温(0℃)时处理快速生长的细菌,
从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形,外源DNA分子在此
条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面,
通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。
在一定条件下,经过连接后的DNA片段与感受态细胞混合保
温,可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的DNA分子通过复
制、表达,实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性
状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转
化体,即带有异源DNA分子的受体细胞。
二、实验所需器材和试剂
器材:
恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作
台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微
量移液枪。
试剂:
:胰化蛋白胨(细菌培养用)10g,酵母提取物(细菌培养用) 5g,NaCl 10g,加ddH2O 至1000ml,完全溶解,分装小瓶,15lbf/in2高压灭菌20min。
%琼脂LB固体培养基: ,加100ml LB,15 lbf/in2 高压灭菌20min,稍冷却,制备平皿。
(或TOP10)
MgCl2 :15 lbf/in2高压灭菌20min,0℃冰浴备用。
CaCl2(以20%甘油水溶液配制):15 lbf/in2高压灭菌20min,0℃冰浴备用。
(Amp),用无菌水配制成100mg/mL 溶液,置-20℃冰箱保存。
三、实验步骤
LB培养液中37℃过夜培养
,37℃-
3. 取3 ,(分两次)
4 ℃ 4000g离心10分钟
4. ,100mM的冰冷CaCl2溶液,摇荡重悬细胞,冰浴30分钟
5. 4℃,4000g离心10分钟,去上清,
加100μl,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,
冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
6. -70℃冻存备用。