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缩略语
CRC Colorectal cancer
FAP Familial adenomatous polyposis
Hereditary non—polyposis colorectal cancer
ACF Aberrant crypt foci
CIN Chromosome instability
MSI Microsatellite instability
MMR Mismatch repair genes
SCRC Sporadic colorectal cancer
PCR Polymerase chain reaction
LOH Loss ofheterozygosity
MCA Methylation CpG islands Amplification
RDA representational difference analysis
Reversed transcription PCR
IHC immunohistochemistry
G3PDH glyceraldehyae 3-phosphate dehydrogenase 5-Bromo-4一Chloro一3一Indolyl—B—D—Galactoside
DEPC Diethyl Pyrocarbonate
EB Etllidium Bromide
ER Estrogen Receptor
DAB ’一Diaminobenzidine
dsRBD double strand RNAbinding domain
mucosa adjacent to colorectal carcinomas
DRBP double strand RNA binding protein
浙江大学博士学位论文
中文摘要
结直肠癌癌旁粘膜CpG岛异常***化的研究
2000级博士研究生 朱益民
导 师 来茂德教授
研究背景
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种严重威胁人类健康的常见消化系统恶性肿瘤。在西方发达国家居民恶性肿瘤死因顺位中结直肠癌位居第二, 在我国恶性肿瘤死因顺位中居4-6位。近二十年来我国结直肠癌发病率基本上呈现上升趋势,特别在城市以及发达农村地区,增速尤其以结肠癌更为明显。随着我国居民生活方式和饮食结构的改变,结直肠癌的危险性还会持续上升。因此结直肠癌发病机制以及防治策略的研究有十分重要意义。
从正常细胞发展到肿瘤是一个漫长而复杂的过程,涉及多阶段、多步骤、多基因作用。随着肿瘤分子生物学研究的深入,发现越来越多的基因改变参与到结直肠癌发生、发展过程,其中癌基因的活化和抑癌基因的失活是基因改变的两个重要方面,涉及遗传与表遗传的改变。遗传性改变是过去20年肿瘤分子生物学研究的基础。表遗传是一种由非DNA序列改变引起的,可遗传的基
因表达水平的变化,包括DNA***化、组蛋白的乙酰化和染色质的构型改变
本项目受国家自然科学基金资助,项目编号30070343
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等。DNA***化是影响表遗传机制的主要因素,基因的5’端启动子和第一外显子CpG岛的***化与基因表达抑制、基因功能缺失有关。,BRCAl,hMLHl等通过DNA异常***化而失活。与正常细胞相比肿瘤细胞的基因组CpG岛的***化状态存在差牙1。因此从研充正常组织和癌
组织差异的***化序列出发,可以寻找新的肿瘤相关(抑癌)基固,这些基因的异常***化可能与肿瘤的发生、发展有关。目前DNA***化的研究已成为肿瘤相关基因特别是抑癌基因研究的新途径。
研究目的
研究结直肠癌癌旁粘膜和正常结肠组织CpG岛***化的分布差异,分析结直肠癌发生早期的异常CpG岛***化改变,探索结直肠癌发生过程中***化作用的(新的)肿瘤相关基因。
对分离到的差异***。
研究方法***化CpG岛扩增方法(MCA)富集基因组内***化CpG岛将基因组DNA 用I'g-*,l性内切酶Sma I消化,灭活后用同裂酶Xma I消化,两次消化产物经
酚/***仿抽提纯化后,在T4 DNA连接酶的作用下与含相同粘端的接头 RXMA24/12连接,然后PCR扩增含有接头的DN***段。代表性差异分析(RJ)A)筛选差异的***化片段将癌旁粘膜的MCA产物用 Xma I消化,切除接头,重新形成粘末端,并与新接头如JXMA24/12、
浙江人学博士学位论文
RMCA24/12等连接,以此作为检测子;用SmaI酶切除正常结肠