文档介绍：PCR扩增产物的电泳分析
琼脂糖凝胶电泳
常用于临床检测(定性)
聚丙烯酰***凝胶电泳
分离效果比琼脂糖好,条带比较集中
可用于科研及检测分析
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琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法
琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物
根据琼溶解温度,把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖
低熔点琼脂糖熔点为62~65℃,溶解后在37℃下维持液体状态约数小时,主要用于DN***段的回收,质粒与外源性DNA的快速连接等
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凝胶浓度选择
琼脂糖浓度(%)
线型DNA分子的分离范围(Kb)
5~60
1~20
~10
~7
~6
~3
~2
琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围
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电泳缓冲液
常用三种缓冲液
Tris-硼酸(TBE)
Tris-乙酸(TAE)
Tris-磷酸(TPE)
TBE与TPE:缓冲容量高,DNA分离效果好,但TPE在DN***段回收时含磷酸盐浓度高,容易使DNA沉淀
TAE:缓冲容量低,但价格较便宜,因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子,从而抑制DNA酶的活性,防止PCR扩增产物降解
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10×TBE缓冲液的配制
配方
Tris 108克
EDTA
硼酸 55克
H2O至 1000ml
~
×TBE(20倍稀释)
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核酸电泳的指示剂
指示剂:
溴酚兰
二甲苯青
溴酚兰:在碱性液体中呈紫兰色
电泳中,溴酚兰的迁移率与双链线性DN***段
琼脂糖凝胶浓度
%
1%
%
2%
迁移率
1Kb
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核酸电泳的指示剂
二甲苯青:水溶液呈兰色,
电泳时,其迁移速率与双链线性DNA大致相当
琼脂糖凝胶浓度
1%
%
迁移率
2Kb
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载样缓冲液
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液
作用:
①增加样品密度,使其比重增加,以确保DNA均匀沉入加样孔内
②在电泳中形成肉眼可见的指 示带,可预测核酸电泳的速度和位置
③使样品呈色,使加样操作更方便
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核酸电泳的染色剂
最常用的染色剂
溴化乙锭
银染色
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核酸电泳的染色剂
溴化乙锭(ethidium bromide,EB)
是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫外线激发下,发出红色荧光
,有时亦可在电泳后,将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10~15min
琼脂糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带,其DNA量一般>5ng
溴化乙锭太多,凝胶染色过深,核酸电泳带看不清时,可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察
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