文档介绍：随着分子生物学技术的发展,聚合酶链反应(PCR)技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断。
1 . 检测临床标本中病原体核酸序列。
2 . 肿瘤基因突变情况。
3 . 遗传性疾病的基因序列。
4 . 人类白细胞表面抗原(HLA)配型。
5 . 法医学方面的鉴定工作。
PCR技术在临床实验室应用的价值
优点:
1. 灵敏度高,理论上,只要标本中含有一个分子的DNA或RNA就可以作出诊断。
2. 特异性强,对于一个19核苷酸的引物来说,非特异性配对的概率为419 = *1011这表示要与这19个碱基的排列顺序完全相同时需要的基因组DN***段的最小长度,而人的基因组长度为3*109碱基对,以克服血清学诊断有交叉反应的缺陷。
3. 可以早期诊断,如在HCV的感染中,第一周内就可以检测出HCV RNA,而抗体的产生一般在第二周以后。
PCR在诊断病原体感染时的优缺点
4. 对于体液免疫力低下或使用免疫抑制剂而无抗体产生者,PCR却可以作出明确诊断。
5. 可以对病原体作定量分析,反映病原体在机体的复制及动力学变化情况。
6. 可对病原体进行基因分型。指导临床治疗。
不足之处:
,技术不易被熟练掌握。
。
,操作步骤多而复杂,即使有极少量的污染也会造成假阳性。
,对试剂及实验条件要求严格,稍有差错就会出现假阴性。
几点认识
:封管、定量及自
动化;
,比操作更重要。
:操作过程的监控、控制假阴性。
、扩增到检测,对照与待测标本
同步进行;
。
进步。
常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时,应使用一次性密闭容器,如真空采血管。当使用非密闭采样系统时,如尿、分泌物和骨髓的采样,必须注意防止来自采样者皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。
玻璃器皿在使用前应高压处理,因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌,250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。
全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝,因为肝素是Taq酶的强抑制剂,而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。
临床用于RNA(如HCV RNA)扩增检测的血标本建议进行抗凝处理,并尽快(3小时以内)分离血浆,以避免RNA的降解。如未作抗凝处理,则抽血后,必须在1小时内分离血清。
用于DNA扩增检测的标本,采集后一般不需特殊的稳定化处理,但标本应及时送至实验室。
由于RNA易受RNA酶的降解,因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理,如流行病学调查的现场采样。异硫***酸胍盐(Guanidine thiocyanate,GITC)可使 DNA酶和RNA酶立即失活,因此在采集标本时,可将标本材料如血清或血浆按1∶4的比例加至含有5mol/L GITC的试管内中,从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后,标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目,上述稳定化处理方法的效果究竟如何,要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。
标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本,通常在运送时,应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本,如果未经稳定化处理,则必须速冻后,放在干冰中运送。
临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10 mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA缓冲液(pH -)中4℃保存,用于 RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃即可。用 GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。