Realtime-PCR的原理和应用.ppt

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Yang Sun, PhD
Product Specialist
主要内容
Realtime PCR的原理
Realtime PCR的问题及解决方法
Realtime PCR的应用
定量起始模板浓度
等位基因的鉴定
产物鉴定
SNP分析
病原菌检测
药厂GMP认证
突变测定
物种鉴定
Real Time PCR的概念
Real time PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。
Ct值
扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。
Real Time PCR的概念
Ct
Ct值
扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。
PCR的原理
NORTHERN
target gene
internal control gene
actin, GAPDH, RPLP0 etc
10X
2X
Ratio target gene in experimental/control = fold change in target gene
fold change in reference gene
control
expt
Corrected fold increase = 10/2 = 5
PCR的原理
理想的PCR反应：
X=X0*2n
非理想的PCR反应：
X=X0(1+Ex)n
n：扩增反应的循环次数
X：第n次循环后的产物量
X0：初始模板量
Ex：扩增效率
Real time PCR的原理
在扩增产物达到阈值线时:
XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)
XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.
在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M
方程式(1)两边同时取对数得:
log M=log X0(1+Ex)Ct(2)
整理方程式(2)得:
log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M (3)
最后结论：
Log X0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量
Real time PCR的原理