利用流式细胞术分析细胞周期时相.pptx

文档介绍：流式细胞术分析细胞周期时相
实验目的
实验原理
仪器、材料与试剂
实验步骤
实验报告及思考题
实验目的
掌握流式细胞仪的工作原理
掌握用流式细胞仪测量细胞群体DNA含量分布的方法
了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用
细胞周期时相分析
实验原理
流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中,在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测,得到该细胞的光散射和荧光指标,分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。
细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化,如G0/G1期的DNA含量为2C,而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法,通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比。
细胞周期时相分析
仪器、材料与试剂
仪器:流式细胞仪,细胞培养设备,离心机,水浴,冰箱
材料:HeLa细胞,5ml注射器,离心管,封口膜,微量移液器,Tips
试剂:70%乙醇(保存于4℃),RNase-A (10mg/ml,-20℃保存),
PI (650µg/ml,避光保存于-20℃),PBS(pH ,保存于4℃)
细胞周期时相分析
实验步骤
取对数生长期细胞,倒去培养液,胰酶适度消化细胞,用培养液吹打,800rpm , 离心 15 min去上清。
PBS洗2次, PBS吹匀,务必吹散。
用5mL注射器将细胞吸起,用力打入5mL 70%(预冷)乙醇中,封口膜封口。4℃固定过夜(可长至2周)
800rpm 15min收集固定细胞,PBS洗2次
PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打(防止细胞破碎)
加RNase-A约3µL至终浓度约为50µg/mL ,37℃水浴消化30 min;
加PI约50µL至终浓度约为65µg/mL ,在冰浴中避光染色30 min。
用300目(孔径40~50微米)尼龙网过滤,上机检测
样品分析测定及打印
细胞周期时相分析
实验报告及思考题
实验报告
标明你所测定的样品中各周期时相的百分比?
思考题
流式细胞术在科学研究中的应用
本实验为何要采用对数生长期的细胞?
细胞周期时相分析