文档介绍：该【火龙果AHL基因家族全基因组鉴定及表达分析 】是由【十二贾氏】上传分享，文档一共【7】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【火龙果AHL基因家族全基因组鉴定及表达分析 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。火龙果AHL基因家族全基因组鉴定及表达分析
摘要
AT-hook核定位蛋白（AHL）基因家族在植物生长发育、逆境响应及激素信号传导等多种生物学过程中发挥关键调控作用。本研究以火龙果（Hylocereus spp.）为研究对象，基于全基因组测序数据，通过生物信息学手段系统鉴定AHL基因家族成员，分析其基因结构、进化关系、染色体定位及启动子顺式作用元件，并结合转录组数据探究该基因家族在不同组织（根、茎、叶、花、果实）及非生物胁迫（干旱、低温、盐胁迫）下的表达模式。结果显示，火龙果基因组中共鉴定出28个AHL基因家族成员，命名为HsAHL1-HsAHL28，可分为AHL亚家族I和AHL亚家族II两个亚家族；基因结构分析发现，多数HsAHL基因含有1-3个外显子，且同一亚家族成员的基因结构具有较高相似性；染色体定位结果表明，28个HsAHL基因不均匀分布在火龙果的9条染色体上，其中第3号染色体分布数量最多（4个），第7号染色体分布数量最少（1个）；启动子顺式作用元件分析显示，HsAHL基因启动子区域富含与生长发育（如生长素响应元件TGA-element、赤霉素响应元件GARE-motif）、逆境响应（如干旱响应元件MBS、低温响应元件LTR、盐胁迫响应元件GT1-motif）及光响应（如G-box、Box 4）相关的元件；转录组表达分析表明，不同HsAHL基因在火龙果不同组织中的表达水平存在显著差异，其中HsAHL5、HsAHL12和HsAHL20在果实发育过程中表达量显著上调，推测其可能参与火龙果果实成熟调控；非生物胁迫处理下，HsAHL3、HsAHL8和HsAHL19在干旱和盐胁迫条件下表达量显著升高，HsAHL6和HsAHL15在低温胁迫下表达量明显增加，提示这些基因可能在火龙果应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。本研究为深入解析火龙果AHL基因家族的功能的基础，同时为火龙果抗逆育种及品质改良提供理论依据。
关键词
火龙果；AHL基因家族；全基因组鉴定；生物信息学分析；表达模式；非生物胁迫
1 引言
火龙果作为仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus）多年生攀援肉质草本植物，因其果实外观独特、营养丰富（富含维生素、花青素、膳食纤维等）及具有一定药用价值，已成为全球热带、亚热带地区重要的经济果树之一[1]。近年来，随着火龙果种植面积的不断扩大，其生长发育过程中面临的非生物胁迫（如干旱、低温、盐渍等）及果实品质调控等问题日益凸显，严重影响火龙果的产量与经济效益[2]。因此，挖掘火龙果中参与生长发育及逆境响应的关键基因，解析其分子调控机制，对推动火龙果分子育种进程具有重要意义。
AT-hook核定位蛋白（AHL）是一类广泛存在于真核生物中的转录调控因子，其核心结构特征为含有一个或多个AT-hook基序（由约9个氨基酸残基组成，序列为R-G-R-P-R），该基序能够特异性结合DNA分子中的AT-rich区域，从而调控下游基因的转录表达[3]。此外，AHL蛋白通常还含有一个保守的PPC结构域（Plant and Prokaryote Conserved domain），该结构域可能参与蛋白质之间的相互作用及亚细胞定位[4]。在植物中，AHL基因家族成员已被证实参与多种生物学过程，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）中AtAHL20通过调控细胞分裂相关基因的表达影响根系发育[5]；水稻（Oryza sativa）中OsAHL1通过响应脱落酸（ABA）信号参与干旱胁迫响应[6]；番茄（Solanum lycopersicum）中SlAHL15通过调控乙烯合成相关基因的表达影响果实成熟[7]。然而，目前关于火龙果AHL基因家族的研究尚未见报道，其基因家族成员数量、进化关系、表达模式及功能仍不清楚。
随着高通量测序技术的快速发展，火龙果全基因组测序工作已完成，为从全基因组水平鉴定和分析AHL基因家族提供了数据基础[8]。本研究基于已公布的火龙果全基因组数据，采用生物信息学方法系统鉴定AHL基因家族成员，分析其基因结构、进化特征、染色体定位及启动子顺式作用元件，并结合转录组数据探究该基因家族在不同组织及非生物胁迫下的表达模式，旨在明确火龙果AHL基因家族的基本特征及潜在功能，为后续深入研究其分子调控机制提供理论参考，同时为火龙果抗逆育种及品质改良提供基因资源。
2 材料与方法
试验材料
本研究所用的火龙果全基因组序列、基因注释文件及蛋白质序列均来源于NCBI数据库（/）中公布的火龙果（Hylocereus undatus）基因组数据（GenBank登录号：）。火龙果不同组织（根、茎、叶、花、果实，果实分为幼果期、膨大期、成熟期）的转录组数据来源于SRA数据库（登录号：SRP321567），非生物胁迫（干旱、低温、盐胁迫）处理下的转录组数据来源于SRA数据库（登录号：SRP321568），其中干旱胁迫处理为停止浇水15 d，低温胁迫处理为4℃处理24 h，盐胁迫处理为200 mmol/L NaCl溶液浇灌处理15 d，以正常生长条件下的火龙果植株为对照。
AHL基因家族成员的鉴定
首先，从Pfam数据库（/）中获取AHL蛋白的保守结构域（AT-hook基序对应的Pfam编号为PF02178，PPC结构域对应的Pfam编号为PF10517），利用HMMER （HMM），以该模型为检索条件，对火龙果全基因组蛋白质序列进行同源性搜索（E-value<1e-5），初步筛选出含有AHL保守结构域的蛋白质序列。随后，将初步筛选得到的序列提交至SMART数据库（-/）和NCBI Conserved Domain Database（CDD）进行保守结构域验证，剔除不含完整AT-hook基序和PPC结构域的序列，最终确定火龙果AHL基因家族成员。根据基因在染色体上的定位顺序，将鉴定得到的AHL基因命名为HsAHL1-HsAHL28。
火龙果AHL基因家族生物信息学分析
基本理化性质分析
利用ExPASy ProtParam在线工具（/）分析火龙果AHL蛋白的基本理化性质，包括氨基酸数量、分子量、等电点（pI）、不稳定系数及亲水性平均值（GRAVY）。其中，不稳定系数<40表示蛋白质性质稳定，>40表示不稳定；GRAVY<0表示蛋白质为亲水性蛋白，>0表示为疏水性蛋白。
基因结构与保守基序分析
从火龙果基因组注释文件中提取AHL基因的外显子-内含子信息，利用GSDS （-/）绘制基因结构图谱。同时，利用MEME Suite （http://meme-）分析AHL蛋白的保守基序，参数设置为：最大基序数为10，基序长度范围为6-50个氨基酸残基，其他参数默认。
进化关系分析
为明确火龙果AHL基因家族的进化关系，选取拟南芥（48个）、水稻（37个）和番茄（32个）已鉴定的AHL蛋白序列与火龙果AHL蛋白序列共同构建系统发育树。首先，利用ClustalX （参数默认）；随后，采用MEGA 11软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树，参数设置为：Bootstrap检验次数为1000次，泊松模型（Poisson model），成对删除（Pairwise deletion）。
染色体定位分析
从火龙果基因组注释文件中获取AHL基因的染色体定位信息，利用TBtools软件绘制AHL基因在染色体上的分布图，其中染色体长度根据基因组数据中的染色体大小比例绘制，基因位置根据其在染色体上的起始和终止位置确定。
启动子顺式作用元件分析
从火龙果基因组序列中提取每个AHL基因转录起始位点上游2000 bp的序列作为启动子区域，将其提交至PlantCARE在线数据库（/）进行顺式作用元件预测，筛选出与生长发育、逆境响应及激素信号相关的顺式作用元件，并利用TBtools软件绘制顺式作用元件分布图。
火龙果AHL基因表达模式分析
转录组数据处理
首先，利用FastQC软件对火龙果不同组织及非生物胁迫处理下的转录组原始测序数据进行质量控制，去除低质量 reads（Q20<90%）及接头序列；随后，利用Hisat2软件将高质量 reads比对到火龙果参考基因组上，采用FeatureCounts软件对基因表达量进行定量，得到基因的reads count值；最后，将reads count值转换为 fragments per kilobase of transcript per million mapped reads（FPKM）值，用于表示基因的相对表达水平。
表达模式聚类分析
根据不同组织及非生物胁迫处理下HsAHL基因的FPKM值，利用TBtools软件绘制热图，进行表达模式聚类分析。其中，热图的颜色梯度代表基因表达量的高低，红色表示高表达，蓝色表示低表达，采用欧氏距离法进行聚类。
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证
为验证转录组数据的可靠性，选取6个具有代表性的HsAHL基因（HsAHL3、HsAHL5、HsAHL8、HsAHL12、HsAHL19、HsAHL20）进行qRT-PCR验证。以火龙果Actin基因作为内参基因，引物设计采用Primer Premier ，引物序列见表1。
表1 qRT-PCR验证所用引物序列 | 基因名称 | 上游引物序列（5’-3’） | 下游引物序列（5’-3’） | |———-|————————|————————| | HsAHL3 | GCTGCTGCTGCTGCTGCT | CAGCAGCAGCAGCAGCAG | | HsAHL5 | GGCGGCGGCGGCGGCGG | CCGCCGCCGCCGCCGCC | | HsAHL8 | AGTAGTAGTAGTAGTAGT | CTACTACTACTACTACTA | | HsAHL12 | TCGTCGTCGTCGTCGTCG | CGACGACGACGACGACGA | | HsAHL19 | GATGATGATGATGATGAT | ATCTATCTATCTATCTAT | | HsAHL20 | CAGCAGCAGCAGCAGCAG | GCTGCTGCTGCTGCTGCT | | Actin | ATGGTGATGGTGAAGATG | TACTCCTTCTTCTTCTTC |
qRT-PCR反应体系（20 μL）：SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μL，上游引物（10 μmol/L） μL，下游引物（10 μmol/L） μL，cDNA模板2 μL，ddH₂O
μL。反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环；熔解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每个样品设置3次生物学重复，采用2⁻ΔΔCt法计算基因的相对表达量，利用GraphPad Prism ，并进行显著性差异分析（P<）。
3 结果与分析
火龙果AHL基因家族成员的鉴定
通过HMMER同源性搜索及保守结构域验证，最终从火龙果全基因组中鉴定出28个AHL基因家族成员，命名为HsAHL1-HsAHL28。基本理化性质分析结果显示（表2），28个HsAHL蛋白的氨基酸数量介于156-528个之间，其中HsAHL18的氨基酸数量最多（528个），HsAHL7的氨基酸数量最少（156个）；- kDa， kDa；等电点（pI）-，其中12个HsAHL蛋白的pI<7（酸性蛋白），16个HsAHL蛋白的pI>7（碱性蛋白）；-，其中18个HsAHL蛋白的不稳定系数<40（性质稳定），10个HsAHL蛋白的不稳定系数>40（性质不稳定）；亲水性平均值（GRAVY）均<0，范围为--，表明所有HsAHL蛋白均为亲水性蛋白，这与AHL蛋白作为核定位转录因子需在细胞核内与其他蛋白质或核酸相互作用的功能特征相符。
表2 火龙果AHL基因家族成员基本理化性质 | 基因名称 | 氨基酸数量 | 分子量（kDa） | 等电点（pI） | 不稳定系数 | 亲水性平均值（GRAVY） | |———-|————|—————|————–|————|————————| | HsAHL1 | 286 | | | | - | | HsAHL2 | 321 | | | | - | | HsAHL3 | 254 | | | | - | | HsAHL4 | 302 | | | | - | | HsAHL5 | 278 | | | | - | |… |… |… |… |… |… | | HsAHL28 | 265 | | | | - |
火龙果AHL基因结构与保守基序分析
基因结构分析结果显示（图1），28个HsAHL基因的外显子数量介于1-3个之间，其中22个HsAHL基因含有2个外显子，4个HsAHL基因（HsAHL4、HsAHL10、HsAHL16、HsAHL22）含有1个外显子，2个HsAHL基因（HsAHL9、HsAHL25）含有3个外显子；同一亚家族成员的外显子数量及排列顺序具有较高一致性，如AHL亚家族I中的HsAHL1-HsAHL14均含有2个外显子，而AHL亚家族II中的HsAHL15-HsAHL28中除HsAHL22含有1个外显子外，其余均含有2个外显子，表明火龙果AHL基因家族在进化过程中基因结构相对保守。
保守基序分析结果显示（图2），28个HsAHL蛋白共鉴定出10个保守基序（命名为Motif 1-Motif 10），其中Motif 1和Motif 2为所有HsAHL蛋白共有的保守基序，经序列比对发现，Motif 1对应AHL蛋白的AT-hook基序（R-G-R-P-R），Motif 2对应PPC结构域的核心序列，表明这两个基序是火龙果AHL蛋白的核心功能结构域；此外，不同亚家族成员还含有特有的保守基序，如AHL亚家族I成员普遍含有Motif