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摘要
黄酮类化合物作为植物源膳食补充剂和天然药物的重要活性成分，其体内生物利用度与肠道菌群介导的代谢转化密切相关。本研究以芹菜素、木犀草素、槲皮素和山奈酚4种典型黄酮苷元为研究对象，采用体外肠道菌群孵育模型，结合超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）技术，建立了黄酮苷元及其代谢产物的系统性分析方法，明确了4种黄酮苷元在肠道菌群作用下的代谢转化路径及特征产物。结果表明，4种黄酮苷元均能被肠道菌群高效代谢，主要发生去羟基化、氢化、甲基化和葡萄糖醛酸化反应，且不同黄酮苷元的代谢速率和产物谱存在显著差异：槲皮素的代谢转化率最高（%±%），主要生成3’-去羟基槲皮素和二氢槲皮素；山奈酚的代谢产物以7-O-甲基山奈酚为主；芹菜素和木犀草素则优先发生B环去羟基化反应，分别生成柚皮素和二氢木犀草素。本研究为阐明黄酮类化合物的体内作用机制及合理设计黄酮类药物递送系统提供了重要的实验依据。
关键词
UHPLC-Q-Orbitrap HRMS；肠道菌群；黄酮苷元；代谢转化；高分辨质谱
1 引言
黄酮类化合物是广泛存在于植物中的多酚类次级代谢产物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及调节代谢等多种生物活性[1]。根据化学结构差异，黄酮类化合物可分为黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷酮等多个亚类，其中芹菜素（黄酮类）、木犀草素（黄酮类）、槲皮素（黄酮醇类）和山奈酚（黄酮醇类）是膳食中最常见的4种黄酮苷元，广泛存在于蔬菜、水果、茶叶及中药材中[2]。然而，黄酮苷元的水溶性较差，且进入人体后易被肝脏代谢为极性更强的结合型产物，导致其生物利用度普遍较低（通常<10%）[3]。近年来研究发现，肠道菌群作为人体“第二基因组”，可通过自身分泌的酶系（如β-葡萄糖苷酶、去羟基化酶、甲基转移酶等）对黄酮苷元进行特异性修饰，生成结构多样的代谢产物，这些代谢产物不仅水溶性增强，且部分产物的生物活性甚至优于母体化合物[4]。因此，系统解析肠道菌群对黄酮苷元的代谢转化规律，是阐明黄酮类化合物体内作用机制的关键环节。
传统的黄酮代谢研究多依赖高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）或液相色谱-三重四极杆质谱（LC-MS/MS）技术，但前者灵敏度低且无法实现未知代谢产物的鉴定，后者虽能通过多反应监测（MRM）模式实现定量分析，但受限于低分辨质谱的质量精度，难以准确确定代谢产物的分子结构[5]。超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）技术结合了UHPLC的高分离效率和Orbitrap质谱的高质量精度（通常<5 ppm）、高分辨率（>100,000 FWHM）及多级质谱（MSn）能力，可通过精确质量数匹配确定化合物的分子式，并利用MS2碎片离子信息解析分子结构，已成为复杂基质中微量代谢产物定性定量分析的首选技术[6]。
本研究基于体外肠道菌群孵育体系，构建了UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析方法，对4种黄酮苷元在肠道菌群作用下的代谢产物进行系统性鉴定，明确代谢转化路径及产物特征，并比较不同黄酮苷元的代谢差异，旨在为黄酮类化合物的体内代谢研究提供技术支撑，同时为基于肠道菌群调控的黄酮类药物研发提供理论基础。
2 材料与方法
实验材料与试剂
芹菜素（纯度≥98%）、木犀草素（纯度≥98%）、槲皮素（纯度≥98%）、山奈酚（纯度≥98%）标准品购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯）购自德国Merck公司；甲酸（质谱纯）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；L-半胱氨酸盐酸盐（还原型，纯度≥98%）购自美国Sigma-Aldrich公司；厌氧培养基（GAM培养基）购自日本Nissui Pharmaceutical公司。
实验仪器
UltiMate 3000超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Q-Exactive Plus四极杆-轨道阱高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；SW-CJ-1FD超净工作台（苏州净化设备有限公司）；THZ-300恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司）；Sigma 3-18K高速离心机（德国Sigma公司）；Mettler Toledo PL2002电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Mill-Q超纯水机（美国Millipore公司）。
肠道菌群的制备
肠道菌群来源于健康成年SD大鼠（雄性，体重200-220 g，购自南京模式动物资源库），实验方案经南京某大学动物伦理委员会批准（伦理编号：SYXK-2024-0012）。大鼠禁食24 h后，采用无菌操作收集新鲜粪便样品（约1 g），立即置于含5 mL厌氧GAM培养基（ g/L L-半胱氨酸盐酸盐，）的离心管中，涡旋振荡10 min后，经8层无菌纱布过滤，去除残渣，得到肠道菌群悬液，备用[7]。
体外肠道菌群孵育实验
分别精密称取4种黄酮苷元标准品，用少量二甲基亚砜（DMSO）溶解后，用厌氧GAM培养基稀释至终浓度为50 μmol/L（DMSO终浓度<%，避免对肠道菌群产生毒性）。 mL上述黄酮苷元溶液置于无菌离心管中， mL肠道菌群悬液（菌液终浓度约为10^8 CFU/mL），混匀后置于37℃厌氧培养箱（5% CO2、10% H2、85% N2）中孵育，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h取样。同时设置空白对照组（仅添加肠道菌群悬液和培养基，无黄酮苷元）和阴性对照组（添加黄酮苷元溶液和无菌培养基，无肠道菌群），每组实验设置3个平行样本[8]。
取样后，向样品中加入4 mL甲醇（%甲酸），涡旋振荡5 min，终止反应，随后于4℃、12000 rpm条件下离心15 min，取上清液；残渣用2
mL甲醇（%甲酸）重复提取1次，合并两次上清液， μm有机相滤膜过滤后，置于棕色进样瓶中，待UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析。
UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析条件
色谱条件
色谱柱：Thermo Scientific Accucore C18柱（ mm×150 mm， μm）；柱温：35℃；进样量：5 μL；流动相：%甲酸水溶液，B相为乙腈；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序如下：0-2 min，5% B；2-10 min，5%-30% B；10-18 min，30%-60% B；18-20 min，60%-95% B；20-22 min，95% B；22- min，95%-5% B；-25 min，5% B；流速： mL/min。
质谱条件
离子源：电喷雾离子源（ESI），负离子模式；扫描范围：m/z 100-1000；分辨率：70000 FWHM（全扫描模式），17500 FWHM（MS2模式）；喷雾电压： kV；鞘气压力：35 Arb；辅助气压力：10 Arb；离子传输管温度：320℃；辅助气温度：350℃；碰撞气：氮气；数据依赖型扫描（DDA）模式：选取全扫描中响应值最高的5个离子进行MS2碎裂，碰撞能量（CE）分别为10 eV、20 eV、30 eV，以获取丰富的碎片离子信息；质量校正：采用外标法，使用Thermo Scientific Pierce LTQ Velos ESI Negative Ion Calibration Solution进行质量校正，确保质量精度<5 ppm[9]。
数据分析方法
采用Thermo Scientific Xcalibur ，通过精确质量数匹配（质量偏差<5 ppm）确定化合物的分子式；结合标准品的保留时间（RT）、MS2碎片离子信息及文献报道的黄酮代谢规律，对4种黄酮苷元的代谢产物进行结构鉴定。采用Thermo Scientific TraceFinder ，以各黄酮苷元及代谢产物的峰面积为指标，计算不同孵育时间点的代谢转化率（代谢转化率=（初始峰面积-剩余峰面积）/初始峰面积×100%），并采用GraphPad Prism
，实验数据以“平均值±标准差（x±s）”表示，组间差异采用单因素方差分析（ANOVA），P<。
3 结果与分析
4种黄酮苷元标准品的UHPLC-Q-Orbitrap HRMS定性分析
在优化的色谱-质谱条件下，4种黄酮苷元标准品实现了良好分离，其保留时间、精确分子离子峰及主要MS2碎片离子信息见表1。以槲皮素为例，其分子式为C15H10O7，在ESI负离子模式下的准分子离子峰为m/z （理论值m/z ，质量偏差- ppm）；MS2碎片离子主要包括m/z （M-H-CH3）、m/z （M-H-CH3-CH3）、m/z （A环碎片）和m/z （B环碎片），与文献报道的槲皮素质谱特征一致[10]。同理，芹菜素（C15H10O5，m/z ）、木犀草素（C15H10O6，m/z ）和山奈酚（C15H10O6，m/z ）的精确分子离子峰及MS2碎片离子均与理论值匹配良好，表明本研究建立的UHPLC-Q-Orbitrap HRMS方法可准确鉴定4种黄酮苷元。
表1 4种黄酮苷元标准品的UHPLC-Q-Orbitrap HRMS特征参数 | 化合物 | 保留时间（min） | 分子式 | 准分子离子峰（m/z） | 理论值（m/z） | 质量偏差（ppm） | 主要MS2碎片离子（m/z） | |———-|——————|———–|———————-|—————|——————|————————————————-| | 芹菜素 | | C15H10O5 | | | - | , , , | | 木犀草素 | | C15H10O6 | | | - | , , , | | 槲皮素 | | C15H10O7 | | | - | , , , | | 山奈酚 | | C15H10O6 | | | - | , , , |
肠道菌群对4种黄酮苷元的代谢产物鉴定
通过对比空白对照组、阴性对照组与实验组的UHPLC-Q-Orbitrap HRMS总离子流图（TIC），发现实验组在孵育2 h后出现多个新增色谱峰，而空白对照组和阴性对照组无明显新增峰，表明这些新增峰为肠道菌群代谢黄酮苷元生成的产物。结合精确质量数、MS2碎片离子及文献报道，共鉴定出4种黄酮苷元的23种代谢产物，其中芹菜素代谢产物5种、木犀草素6种、槲皮素7种、山奈酚5种，主要代谢产物的结构及质谱特征见表2。
从代谢反应类型来看，4种黄酮苷元在肠道菌群作用下的代谢路径具有共性，主要包括以下4类反应： （1）去羟基化反应：黄酮苷元B环或A环上的羟基被氢取代，如槲皮素（B环3’、4’位羟基）在去羟基化酶作用下生成3’-去羟基槲皮素（m/z ），木犀草素（B环3’、4’位羟基）生成3’-去羟基木犀草素（m/z ）； （2）氢化反应：黄酮母核的C2-C3双键被氢化还原为单键，生成黄烷酮类产物，如芹菜素氢化生成柚皮素（m/z ），槲皮素氢化生成二氢槲皮素（m/z ）； （3）甲基化反应：黄酮苷元羟基上的氢被甲基取代，主要发生在7位或4’位羟基，如山奈酚甲基化生成7-O-甲基山奈酚（m/z ），木犀草素甲基化生成4’-O-甲基木犀草素（m/z ）； （4）葡萄糖醛酸化反应：黄酮苷元或其初级代谢产物与葡萄糖醛酸结合，生成葡萄糖醛酸苷类产物，如槲皮素葡萄糖醛酸化生成槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（m/z ），山奈酚葡萄糖醛酸化生成山奈酚-7-O-葡萄糖醛酸苷（m/z ）。
表2 4种黄酮苷元主要肠道菌群代谢产物的UHPLC-Q-Orbitrap HRMS特征参数 | 母体化合物 | 代谢产物名称 | 保留时间（min） | 分子式 | 准分子离子峰（m/z） | 质量偏差（ppm） | 主要MS2碎片离子（m/z） | 代谢反应类型 | |————|——————–|——————|———–|———————-|——————|————————————————-|————–| | 芹菜素 | 柚皮素 | | C15H12O5 | | - | , , , |
氢化 | | 芹菜素 | 3’-去羟基芹菜素 | | C15H10O4 | | - | , , ,