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摘要
本研究旨在探讨芪参益心颗粒对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）联合高脂饮食诱导的小鼠微循环血管内皮功能障碍的改善效果，并阐明其潜在作用机制。将60只SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为正常对照组、模型组、芪参益心颗粒低剂量组（）、中剂量组（5g/kg）、高剂量组（10g/kg）及阳性对照药缬沙坦组（10mg/kg），每组10只。除正常对照组外，其余各组通过皮下埋植AngⅡ渗透泵（）联合高脂饮食（脂肪含量45%）建立微循环血管内皮功能障碍模型，建模同时给予相应药物干预，连续4周。干预结束后，检测小鼠尾动脉收缩压（SBP）；采用激光多普勒血流仪测定耳廓微循环血流灌注量；通过伊文思蓝（EB）渗漏实验评估血管内皮通透性；酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）水平；Western blot法检测主动脉组织中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、磷酸化eNOS（p-eNOS）、核因子-κB p65（NF-κB p65）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）蛋白表达；HE染色观察主动脉组织病理形态变化。结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠SBP显著升高（P<），耳廓微循环血流灌注量显著降低（P<），EB渗漏量显著增加（P<），血清NO水平显著降低（P<），ET-1、TNF-α、IL-6水平显著升高（P<），主动脉组织p-eNOS/eNOS比值显著降低（P<），p-NF-κB p65/NF-κB p65比值显著升高（P<），主动脉内膜增厚、内皮细胞损伤、平滑肌细胞增生及炎性细胞浸润明显。与模型组相比，芪参益心颗粒各剂量组及缬沙坦组小鼠SBP显著降低（P<<），耳廓微循环血流灌注量显著增加（P<<），EB渗漏量显著减少（P<<），血清NO水平显著升高（P<<），ET-1、TNF-α、IL-6水平显著降低（P<<），主动脉组织p-eNOS/eNOS比值显著升高（P<<），p-NF-κB p65/NF-κB
p65比值显著降低（P<<），主动脉组织病理损伤程度明显减轻，且芪参益心颗粒的作用呈一定剂量依赖性。结论：芪参益心颗粒可有效改善AngⅡ联合高脂诱导的小鼠微循环血管内皮功能障碍，其机制可能与调节eNOS/NO通路、抑制NF-κB介导的炎症反应有关。
关键词
芪参益心颗粒；血管紧张素Ⅱ；高脂饮食；微循环；血管内皮功能障碍；eNOS/NO通路；NF-κB；炎症反应
1 引言
微循环是血液循环系统中直接参与组织细胞物质交换的关键环节，而血管内皮细胞作为微循环血管壁的重要组成部分，不仅承担着物理屏障功能，还通过分泌一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）等多种活性物质，调控血管舒张收缩、维持血管通透性及抑制炎症反应，对维持微循环稳态至关重要[1]。当血管内皮细胞受损时，其功能发生障碍，可导致微循环灌注不足、组织缺氧缺血，进而诱发高血压、动脉粥样硬化、糖尿病血管并发症等多种心血管疾病[2]。
血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素系统（RAS）的主要效应分子，可通过激活AngⅡ type 1受体（AT1R），促进氧化应激、炎症反应及血管平滑肌细胞增殖，直接损伤血管内皮细胞[3]。同时，长期高脂饮食可导致血脂异常，使低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）在血管内皮下沉积，形成脂质斑块，进一步加重血管内皮损伤，二者协同作用可显著加剧微循环血管内皮功能障碍的发生发展[4]。目前，临床常用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）如缬沙坦改善血管内皮功能，但部分患者长期使用易出现干咳、低血压等不良反应，且对微循环的改善效果仍有提升空间[5]。
芪参益心颗粒是基于中医“益气活血、通络止痛”理论研制的中药复方制剂，主要由黄芪、丹参、人参、麦冬、五味子等药材组成。现代药理学研究表明，黄芪中的黄芪甲苷可通过激活eNOS促进NO生成，改善血管内皮功能[6]；丹参中的丹参酮ⅡA可抑制NF-κB炎症通路，减轻血管炎性损伤[7]；人参中的人参皂苷Rg1可调节脂质代谢，减少脂质沉积[8]。前期临床研究发现，芪参益心颗粒可改善冠心病患者的心肌微循环灌注，缓解心绞痛症状[9]，但其对AngⅡ联合高脂诱导的微循环血管内皮功能障碍的作用及机制尚未明确。因此，本研究通过建立AngⅡ联合高脂饮食诱导的小鼠微循环血管内皮功能障碍模型，系统探讨芪参益心颗粒的改善作用及分子机制，为其临床应用提供实验依据。
2 材料与方法
实验动物
SPF级C57BL/6雄性小鼠60只，8-10周龄，体重22-25g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2023-0001。小鼠饲养于山西医科大学实验动物中心SPF级动物房，温度（23±2）℃，湿度（50±5）%，12h光暗循环，自由摄食饮水，适应性饲养1周后开始实验。本实验经山西医科大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：SYXK（晋）2023-0005），严格遵循《实验动物伦理审查指南》进行操作。
实验药物与试剂
芪参益心颗粒（规格：5g/袋，批号：20230315），由山西某中药制药有限公司提供，临用时用生理盐水配制成25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL的混悬液；缬沙坦胶囊（规格：80mg/粒，批号：20230210），由北京诺华制药有限公司生产，临用时用生理盐水配制成1mg/mL的溶液；AngⅡ（纯度≥98%，批号：A9525），购自美国Sigma-Aldrich公司；高脂饲料（脂肪含量45%，批号：20230401），购自江苏美迪森生物医药有限公司；NO检测试剂盒（批号：20230508）、ET-1检测试剂盒（批号：20230510）、TNF-α检测试剂盒（批号：20230512）、IL-6检测试剂盒（批号：20230515），均购自上海酶联生物科技有限公司；eNOS抗体（批号：ab76198）、p-eNOS抗体（Ser1177，批号：ab234431）、NF-κB p65抗体（批号：ab16502）、p-NF-κB p65抗体（Ser536，批号：ab86299）、β-actin抗体（批号：ab8226），均购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗（批号：A0208），购自碧云天生物技术有限公司；伊文思蓝（EB，批号：E2149），购自美国Amresco公司；其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
实验仪器
BP-2010A小鼠尾动脉血压测量仪（成都泰盟软件有限公司）；PeriScan PIM 3激光多普勒血流仪（瑞典Perimed公司）；Multiskan FC酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDoc XRS+化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）；RM2235石蜡切片机（德国Leica公司）；BX53光学显微镜（日本Olympus公司）；渗透泵（型号：Alzet 2004，容量200μL，），购自美国DURECT公司。
动物分组与模型建立
将60只小鼠随机分为6组，每组10只： 1. 正常对照组：给予普通饲料喂养，皮下埋植含生理盐水的渗透泵，同时灌胃给予等体积生理盐水，每日1次，连续4周； 2. 模型组：给予高脂饲料喂养，皮下埋植含AngⅡ的渗透泵（AngⅡ，根据小鼠体重计算所需AngⅡ剂量，用生理盐水溶解后注入渗透泵），同时灌胃给予等体积生理盐水，每日1次，连续4周； 3. 芪参益心颗粒低剂量组（QS-L组）：高脂饲料喂养+AngⅡ渗透泵埋植，（按小鼠体重20g计算，），每日1次，连续4周； 4. 芪参益心颗粒中剂量组（QS-M组）：高脂饲料喂养+AngⅡ渗透泵埋植，同时灌胃给予芪参益心颗粒混悬液5g/kg，每日1次，连续4周； 5. 芪参益心颗粒高剂量组（QS-H组）：高脂饲料喂养+AngⅡ渗透泵埋植，同时灌胃给予芪参益心颗粒混悬液10g/kg，每日1次，连续4周； 6. 缬沙坦组（VAL组）：高脂饲料喂养+AngⅡ渗透泵埋植，同时灌胃给予缬沙坦溶液10mg/kg，每日1次，连续4周。
渗透泵埋植方法：小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉后，背部剃毛消毒，，分离皮下组织形成囊袋，将充满AngⅡ溶液或生理盐水的渗透泵放入囊袋中，确保泵体开口朝向身体远端，分层缝合皮肤，术后肌肉注射青霉素钠（10万U/kg）预防感染，连续3d。
检测指标与方法
小鼠尾动脉收缩压（SBP）测定
分别于实验开始前（基线）及实验第1、2、3、4周末，采用小鼠尾动脉血压测量仪测定各组小鼠SBP。测量前将小鼠置于37℃恒温箱中预热15min，待小鼠安静后，将尾动脉套入血压计袖带，连续测量3次，取平均值作为该小鼠的SBP值。
耳廓微循环血流灌注量测定
实验第4周末，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，将耳廓平展固定于载物台上，采用激光多普勒血流仪测定耳廓微循环血流灌注量，选择耳廓中部区域作为检测点，每个检测点连续测量3次，记录血流灌注量数值（单位：PU），取平均值。
血管内皮通透性检测（EB渗漏实验）
耳廓微循环血流灌注量测定结束后，小鼠尾静脉注射2% EB溶液（50mg/kg），注射后30min，脱颈处死小鼠，迅速取下双侧耳廓，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分，称重后放入含500μL甲酰胺的离心管中，60℃恒温水浴孵育24h，期间每隔6h振荡1次，使EB充分溶解。孵育结束后，4℃、12000r/min离心15min，取上清液，用酶标仪在620nm波长处测定吸光度（A）值。根据EB标准曲线（y=+，R²=，其中y为A值，x为EB浓度μg/mL）计算上清液中EB浓度，再根据公式计算耳廓EB渗漏量：EB渗漏量（μg/g）=（上清液EB浓度×甲酰胺体积）/耳廓重量。
血清NO、ET-1、TNF-α、IL-6水平检测
小鼠脱颈处死后，立即通过眼眶静脉丛取血，置于不含抗凝剂的离心管中，室温静置30min，3000r/min离心15min，分离血清，按照各ELISA检测试剂盒说明书操作，测定血清中NO、ET-1、TNF-α、IL-6水平，记录酶标仪检测的A值，根据标准曲线计算各指标浓度。
主动脉组织eNOS、p-eNOS、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达检测（Western blot法）
小鼠处死后，迅速分离主动脉组织，去除周围脂肪组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上研磨至匀浆，4℃、12000r/min离心30min，取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，调整各样本蛋白浓度一致后，加入5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸10min使蛋白变性。取20μg蛋白样本进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2h，加入一抗（eNOS、p-eNOS、NF-κB p65、p-NF-κB p65抗体稀释比例均为1:1000，β-actin抗体稀释比例为1:5000），4℃孵育过夜。次日，TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，加入HRP标记的二抗（稀释比例1:5000），室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。最后，加入ECL化学发光底物，用化学发光成像系统拍摄条带，采用ImageJ软件分析各条带灰度值，以β-actin为内参，计算目标蛋白与β-actin灰度值的比值，以及p-eNOS/eNOS、p-NF-κB p65/NF-κB p65的比值。
主动脉组织病理形态观察（HE染色）
分离小鼠主动脉组织，用4%多聚甲醛固定24h，梯度脱水（70%、80%、90%、95%、100%乙醇）、二甲苯透明、石蜡包埋，制作5μm厚的连续切片。切片经脱蜡至水后，苏木精染液染色5min，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化30s，自来水返蓝10min，伊红染液染色2min，梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。在光学显微镜下观察主动脉组织病理形态变化，拍照记录，采用Image-Pro Plus ，计算内膜厚度/中膜厚度（I/M）比值。
统计学方法
采用SPSS ，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验，P<。
3 结果
芪参益心颗粒对模型小鼠SBP的影响
实验开始前，各组小鼠SBP比较，差异无统计学意义（P>）。实验第1周末起，模型组小鼠SBP显著高于正常对照组（P<），且随时间推移持续升高；与模型组相比，芪参益心颗粒各剂量组及缬沙坦组小鼠SBP从第2周末开始显著降低（P<<），且芪参益心颗粒高剂量组降低效果优于低、中剂量组（P<）。实验第4周末，各组SBP结果如下：正常对照组（±）mmHg，模型组（±）mmHg，QS-L组（±）mmHg，QS-M组（±）mmHg，QS-H组（±）mmHg，VAL组（±）mmHg。结果表明，芪参益心颗粒可显著降低AngⅡ联合高脂诱导的模型小鼠SBP，且呈