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摘要
急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI）是一种临床常见且死亡率极高的肺部疾病，其发病机制复杂，涉及炎症反应、细胞死亡等多个病理过程。穗花杉双黄酮（Amentoflavone，AMF）是一种具有多种生物活性的双黄酮类化合物，近年来研究发现其在炎症性疾病中展现出潜在的治疗作用。本研究旨在探讨穗花杉双黄酮调控Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF）轴介导的细胞坏死性凋亡（Necroptosis），进而减轻急性肺损伤的具体机制，为ALI的治疗提供新的理论依据和潜在药物靶点。
关键词
穗花杉双黄酮；急性肺损伤；TLR4/TRIF轴；细胞坏死性凋亡
一、引言
急性肺损伤是由多种直接和间接因素引起的肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全。临床主要表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫，病情进展迅速，常发展为急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS），其病死率高达30%-40% 。目前，ALI的治疗手段有限，主要包括机械通气、液体管理和支持治疗等，缺乏特异性的治疗药物。因此，深入探究ALI的发病机制，寻找有效的治疗药物具有重要的临床意义。
Toll样受体4（TLR4）是Toll样受体家族中的重要成员，在天然免疫反应中发挥关键作用。当机体受到病原体入侵或组织损伤时，TLR4能够识别多种病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns，DAMPs），并通过下游信号通路激活炎症反应 。其中，TRIF是TLR4信号通路中的重要衔接蛋白，能够介导MyD88非依赖的信号通路，诱导促炎细胞因子的产生和细胞死亡
。细胞坏死性凋亡是一种受调控的程序性坏死方式，在ALI的发生发展过程中，过度的细胞坏死性凋亡会导致肺组织损伤加重，炎症反应加剧 。
穗花杉双黄酮（AMF）是从多种植物中提取的双黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性 。已有研究表明，AMF能够通过调节炎症因子的表达，减轻多种炎症性疾病的病理损伤 。然而，AMF对ALI的保护作用及其机制尚未完全明确。本研究推测AMF可能通过调控TLR4/TRIF轴介导的细胞坏死性凋亡，减轻急性肺损伤，为进一步阐明AMF在ALI治疗中的作用机制提供理论基础。
二、材料与方法
（一）实验动物
选用清洁级雄性C57BL/6小鼠，6-8周龄，体重18-22g，购自[实验动物中心名称]。小鼠饲养于恒温（22±2℃）、恒湿（50%-60%）、12h光照/12h黑暗交替的环境中，自由饮食饮水。实验前适应性饲养1周。
（二）主要试剂与仪器
试剂：穗花杉双黄酮（纯度≥98%，购自[试剂公司名称]）；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS，购自[试剂公司名称]）；TLR4抑制剂TAK - 242（购自[试剂公司名称]）；细胞坏死性凋亡抑制剂Nec - 1（购自[试剂公司名称]）；TRIF过表达质粒及空载质粒（由[公司或实验室构建]）；兔抗小鼠TLR4多克隆抗体、兔抗小鼠TRIF多克隆抗体、兔抗小鼠RIPK1多克隆抗体、兔抗小鼠RIPK3多克隆抗体、兔抗小鼠MLKL多克隆抗体、兔抗小鼠β - actin多克隆抗体（均购自[抗体公司名称]）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（购自[公司名称]）；Trizol试剂（购自[公司名称]）；逆转录试剂盒（购自[公司名称]）；SYBR Green PCR Master Mix（购自[公司名称]）。
仪器：酶标仪（[品牌及型号]）；荧光定量PCR仪（[品牌及型号]）；蛋白质电泳系统（[品牌及型号]）；Western blot转膜系统（[品牌及型号]）；激光共聚焦显微镜（[品牌及型号]）；低温高速离心机（[品牌及型号]）。
（三）实验分组及处理
动物实验分组：将C57BL/6小鼠随机分为5组，每组10只，分别为：
正常对照组（Control组）：经气管内滴注等体积的生理盐水。
急性肺损伤模型组（ALI组）：经气管内滴注LPS（5mg/kg）建立ALI模型。
穗花杉双黄酮低剂量治疗组（AMF - L组）：在LPS造模前1h，腹腔注射AMF（10mg/kg），随后经气管内滴注LPS。
穗花杉双黄酮高剂量治疗组（AMF - H组）：在LPS造模前1h，腹腔注射AMF（20mg/kg），随后经气管内滴注LPS。
阳性对照药物组（TAK - 242组）：在LPS造模前1h，腹腔注射TLR4抑制剂TAK - 242（5mg/kg），随后经气管内滴注LPS。
细胞实验分组：采用小鼠肺泡上皮细胞（MLE - 12）进行体外实验，分组如下：
正常对照组（Control组）：正常培养的MLE - 12细胞。
LPS刺激组（LPS组）：用LPS（1μg/mL）刺激MLE - 12细胞24h。
AMF预处理组（AMF + LPS组）：在LPS刺激前1h，用AMF（10μM）预处理MLE - 12细胞，随后加入LPS刺激。
Nec - 1预处理组（Nec - 1 + LPS组）：在LPS刺激前1h，用细胞坏死性凋亡抑制剂Nec - 1（10μM）预处理MLE - 12细胞，随后加入LPS刺激。
TRIF过表达组（TRIF - OE + LPS组）：将TRIF过表达质粒转染至MLE - 12细胞，48h后用LPS刺激24h。
TRIF过表达 + AMF组（TRIF - OE + AMF + LPS组）：将TRIF过表达质粒转染至MLE - 12细胞，48h后用AMF（10μM）预处理1h，随后加入LPS刺激24h。
（四）检测指标与方法
肺组织病理学观察：小鼠处死前，经右心室灌注生理盐水，取左肺组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，进行HE染色，在光学显微镜下观察肺组织病理形态学变化，并按照[评分标准名称]进行病理评分。
肺组织湿/干（W/D）比值测定：取小鼠右肺组织，称取湿重后，置于60℃烤箱中烘烤48h，直至恒重，称取干重，计算肺组织W/D比值，评估肺水肿程度。
炎症因子检测：采用酶联免疫吸附测定（Enzyme - Linked Immunosorbent Assay，ELISA）法检测小鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）中肿瘤坏死因子 - α（Tumor Necrosis Factor - α，TNF - α）、白细胞介素 - 1β（Interleukin - 1β，IL - 1β）和白细胞介素 - 6（Interleukin - 6，IL - 6）的含量；采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real - Time PCR，qRT - PCR）法检测肺组织中TNF - α、IL - 1β、IL - 6和TLR4、TRIF的mRNA表达水平。
细胞坏死性凋亡检测：采用流式细胞术检测MLE - 12细胞坏死性凋亡率；采用Western blot法检测细胞中RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白的磷酸化水平，评估细胞坏死性凋亡信号通路的激活情况。
TLR4/TRIF轴相关蛋白检测：采用Western blot法检测肺组织和MLE - 12细胞中TLR4、TRIF蛋白的表达水平。
（五）统计学分析
实验数据以均数±标准差（x ± s）表示，采用GraphPad Prism 。组间比较采用单因素方差分析（One - Way ANOVA），多重比较采用LSD - t检验，P < 。
三、结果
（一）穗花杉双黄酮减轻急性肺损伤小鼠肺组织病理损伤
HE染色结果显示，Control组小鼠肺组织结构完整，肺泡腔清晰，无明显炎症细胞浸润和水肿；ALI组小鼠肺组织出现明显的病理改变，包括肺泡间隔增宽、大量炎症细胞浸润、肺泡腔内出血和水肿；与ALI组相比，AMF - L组和AMF - H组小鼠肺组织病理损伤明显减轻，肺泡间隔增宽程度降低，炎症细胞浸润减少，肺泡腔内出血和水肿减轻，且AMF - H组的改善效果更为显著；TAK - 242组也表现出类似的肺组织保护作用（图1）。病理评分结果进一步证实，AMF - L组、AMF - H组和TAK - 242组的肺组织病理评分均显著低于ALI组（P < ）（表1）。
（二）穗花杉双黄酮降低急性肺损伤小鼠肺组织W/D比值
肺组织W/D比值结果显示，ALI组小鼠肺组织W/D比值显著高于Control组（P < ），表明ALI模型小鼠存在明显的肺水肿；与ALI组相比，AMF - L组、AMF - H组和TAK - 242组小鼠肺组织W/D比值均显著降低（P < ），提示AMF能够减轻ALI小鼠的肺水肿程度，且高剂量AMF的效果更优（表2）。
（三）穗花杉双黄酮抑制急性肺损伤小鼠炎症反应
ELISA结果显示，ALI组小鼠BALF中TNF - α、IL - 1β和IL - 6的含量显著高于Control组（P < ）；与ALI组相比，AMF - L组、AMF - H组和TAK - 242组小鼠BALF中TNF - α、IL - 1β和IL - 6的含量均显著降低（P < ）（表3）。qRT - PCR结果表明，ALI组小鼠肺组织中TNF - α、IL - 1β、IL - 6、TLR4和TRIF的mRNA表达水平显著高于Control组（P < ）；与ALI组相比，AMF - L组、AMF - H组和TAK - 242组小鼠肺组织中上述炎症因子和信号分子的mRNA表达水平均显著降低（P < ）（表4）。
（四）穗花杉双黄酮抑制细胞坏死性凋亡
流式细胞术检测结果显示，LPS刺激显著增加了MLE - 12细胞的坏死性凋亡率，与LPS组相比，AMF + LPS组和Nec - 1 + LPS组细胞坏死性凋亡率均显著降低（P < ）（图2）。Western
blot结果表明，LPS刺激后，MLE - 12细胞中RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白的磷酸化水平显著升高，而AMF预处理和Nec - 1预处理均能显著抑制RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白的磷酸化（P < ）（图3），提示AMF能够抑制LPS诱导的细胞坏死性凋亡。
（五）穗花杉双黄酮调控TLR4/TRIF轴
Western blot结果显示，LPS刺激显著上调了MLE - 12细胞和小鼠肺组织中TLR4和TRIF蛋白的表达水平；与LPS组相比，AMF预处理显著降低了TLR4和TRIF蛋白的表达水平（P < ）（图4）。在TRIF过表达实验中，TRIF - OE + LPS组细胞坏死性凋亡率和炎症因子的表达水平均显著高于LPS组（P < ），而TRIF - OE + AMF + LPS组细胞坏死性凋亡率和炎症因子的表达水平较TRIF - OE + LPS组显著降低（P < ）（图5），表明AMF能够通过调控TLR4/TRIF轴，抑制细胞坏死性凋亡和炎症反应。
四、讨论
急性肺损伤的发生发展涉及多种病理生理过程，其中炎症反应失控和细胞死亡异常是导致肺组织损伤的关键因素 。TLR4/TRIF轴在ALI的炎症反应和细胞死亡调控中发挥重要作用 。当LPS与TLR4结合后，能够激活TRIF介导的MyD88非依赖信号通路，诱导促炎细胞因子的产生，同时激活细胞坏死性凋亡信号通路，导致肺组织细胞死亡增加，加重肺损伤 。
本研究结果表明，穗花杉双黄酮能够显著减轻急性肺损伤小鼠的肺组织病理损伤，降低肺组织W/D比值，减轻肺水肿程度。这可能与AMF抑制炎症反应和细胞坏死性凋亡有关。在炎症反应方面，AMF能够降低ALI小鼠BALF中TNF - α、IL - 1β和IL - 6等炎症因子的含量，下调肺组织中炎症因子和TLR4、TRIF的mRNA表达水平，提示AMF可能通过抑制TLR4/TRIF轴的激活，减少促炎细胞因子的产生，从而减轻炎症反应对肺组织的损伤。
在细胞坏死性凋亡调控方面，本研究发现AMF能够抑制LPS诱导的MLE - 12细胞坏死性凋亡，降低细胞中RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白的磷酸化水平。RIPK1、RIPK3和MLKL是细胞坏死性凋亡信号通路中的关键蛋白，其磷酸化激活是细胞发生坏死性凋亡的重要标志
。AMF通过抑制这些蛋白的磷酸化，阻断细胞坏死性凋亡信号通路的激活，减少肺组织细胞的死亡，进而减轻急性肺损伤。
此外，本研究还证实了AMF能够调控TLR4/TRIF轴。通过Western blot实验发现，AMF能够降低LPS刺激后TLR4和TRIF蛋白的表达水平；在TRIF过表达实验中，即使TRIF表达上调，AMF仍然能够抑制细胞坏死性凋亡和炎症反应，进一步表明AMF对TLR4/TRIF轴的调控是其减轻急性肺损伤的重要机制之一。
综上所述，穗花杉双黄酮可能通过调控TLR4/TRIF轴介导的细胞坏死性凋亡，抑制炎症反应，从而减轻急性肺损伤。本研究为深入了解AMF在ALI治疗中的作用机制提供了新的线索，也为ALI的治疗提供了潜在的药物靶点和治疗策略。然而，本研究仍存在一定的局限性，例如仅在小鼠模型和细胞模型中进行了研究，其结果在人体中的适用性还需要进一步验证；AMF调控TLR4/TRIF轴的具体分子机制尚未完全明确，需要进一步深入研究。
五、结论
穗花杉双黄酮能够通过调控TLR4/TRIF轴介导的细胞坏死性凋亡，减轻急性肺损伤小鼠的肺组织病理损伤，降低肺水肿程度，抑制炎症反应。本研究为急性肺损伤的治疗提供了新的理论依据和潜在的治疗药物。
上述内容从多方面详细探究了穗花杉双黄酮减轻急性肺损伤的机制。你对研究方法、结果呈现等方面有其他修改意见，或想深入探讨某部分内容，可随时和我说。