文档介绍：缩略语表
缩略词英文全称中文全称
rpm revolutions per minute 每分钟转数;转/分
min minute 分钟
h hour 小时
s second 秒
pMIR-R-L pMIR-REPORTTM Luciferase 荧光素酶报告载体
NC negative control 随机序列阴性对照
Renilla-L Renilla Luciferase 海肾荧光素酶
DMSO dimethyl sulfoxide 二***亚砜
MTT 3-(4,5dimethylthiahiazol-2-y1)-2,5-di-
-phenyltetrazolium bromide
噻唑蓝
miR-15a microRNA-15a 微小 RNA-15a
miR-16-1 microRNA-16-1 微小 RNA-16-1
3’-UTR 3’-Untranslated Regions 3’非编码区
PCR polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
miR-15a 和 miR-16-1 在骨肉瘤细胞凋亡机制中的作用
博士研究生:蔡承魁
导师:马保安教授第四军医大学唐都医院骨科,西安 710038
资助基金项目:国家自然科学基金(81072194)
中文摘要
背景:
骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,临床上由于该肿瘤发病及进展迅速,早期易转移,治疗过程中容易产生耐药,致使许多患者失去生命。而导致骨肉瘤发生和发展的机制仍未被研究透彻。已有的实验成果认为,在癌细胞的基本代谢活动过程中,miR-15a 和 miR-16-1 起到了重要调控作用。研究它们在骨肉瘤细胞内的具体功能有望进一步完善该肿瘤发生和发展的机制。
目的:
本实验旨在发现并验证 miR-15a 和 miR-16-1 在骨肉瘤细胞中的异常表达状态, 研究它们对细胞生命程序的影响,揭示其在骨肉瘤细胞凋亡机制中的作用。
方法:
1. 选取 34 例骨肉瘤病理蜡块样本进行实时定量 PCR 分析,并与前期组织芯片结果对比,分析差异表达情况。
2. 采用瞬时转染法构建高表达 miR-15a 和 miR-16-1 的骨肉瘤细胞系,观察转染效果并计算转染效率。
3. 搜集转染 48 小时后的存活细胞,使用 TUNEL、流式细胞仪及 MTT 法研究高表达
miR-15a 和 miR-16-1 的 SOSP-9607 细胞在细胞周期、凋亡及增殖过程中的变化。
4. 利用基因信息学软件、文献回顾及 RT-PCR 实验方法确定靶基因研究对象。
5. 使用免疫组织化学、Western blot、RT-PCR 及荧光素酶报告基因依次从组织细胞、蛋白、mRNA 及 DNA 水平验证靶基因。
结果:
1. 34 例骨肉瘤蜡块标本中 miR-15a 和 miR-16-1 的相对表达定量与瘤旁标本相比有所降低,统计学分析有差异(P<)。
2. 转染 4 小时后,经过镜下观察并计算转染效率,结果表明转染成功,可用于后续实验。
3. 转染 48 小时后,流式细胞仪和 TUNEL 法凋亡检测结果表明高表达 miR-15a 和
miR-16-1 的 SOSP-9607 细胞凋亡率较抑制物组和对照组相比,显著增加
(P<)。流式细胞仪周期分析结果显示转染后处于 G0/G1 期的细胞明显多于对照组,说明细胞周期减缓(P<)。以 MTT 法绘制的细胞增殖曲线显示转染后的肿瘤细胞增殖速度较其他组有所减缓(P<)。上述实验中,抑制物组和对照组的组间和组内结果对比均无差异(P>)。
4. 经过基因信息学软件筛选,文献回顾分析以及 RT-PCR 的初步筛查,最终确定 ND1。
5. 荧光素酶报告基因分析结果揭示出 miR-15a 和 miR-16-1 ND1-b 组的荧光强度(P<),ND1-a 组则不受影响(P>)。说明 miR-15a 和 miR-16-1 ND1 基因 3’UTR ND1-b ND1 基因的表达。
结论:
miR-15a 和 miR-16-1 ND1 基因表达促进 SOSP-9607 细胞凋亡、阻抑细胞周期,抑制细胞增殖。
关键词:骨肉瘤;miR-15a;miR-16-ND1;细胞凋亡
Effects of MiR-15a and MiR-16-1 in Apoptosis Process of a
Candidate for master: Chengkui Cai Supervisor: Prof. Baoan Ma
Tutor: Prof. Baoan Ma
Department of orthopaedics, T