文档介绍：人doppel蛋白及其类似蛋白PrPΔ32
:徐琨,王新,田婵,石崧,王桂荣石琦,周瑞敏,姜惠英,楚雍烈,董小平
【摘要】目的体外观察细胞瞬时表达的人Dpl(doppel)蛋白对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用,并与其结构类似蛋白——截短型PrP(PrPΔ32-121)加以比较。方法通过PCR方法获得人PRND基因及截短型PRNP基因并克隆至真核表达载体,瞬时转染SH-SY5Y细胞后,观察蛋白表达及其定位情况;采用MTT实验检测转染细胞的生长状态;用流式细胞仪、TT结果显示,在转染24h后均出现明显的细胞毒性作用;细胞凋亡相关实验发现,转染细胞Annexin V/PI双染阳性细胞数量增多,pro-casepase-3和Bcl-2因子水平降低。结论瞬时表达的Dpl蛋白与截短型PrP可产生类似的神经细胞毒性作用,并诱导启动细胞凋亡过程。
【关键词】 doppel蛋白;朊蛋白;细胞毒性作用;细胞凋亡
ChinaABSTRACT: Objective To observe the biological activities of human doppel (Dpl) protein transiently expressed and Dpl-like protein PrPΔ32-121 on a human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Methods Rebinant mammalian expression plasmids containing human PRND gene and truncated PrPΔ32-121 fragment easured by MTT analysis. Cellular apoptosis etry and EM购自美国Gibco公司;M2000购自美国Invitrogen公司;PrP特异性单克隆抗体3F4购自丹麦Deko公司;6G3、β-actin和Bcl-2单克隆抗体及Dpl、Bax和casepase-3多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司;ECL Kit购自美国Perkin-Elmer公司;四***偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司;Annexin V/PI双染试剂盒购自上海宝赛生物公司。
真核表达质粒的构建
-huPrP1--huDpl1-176由本室保存。-huPrPΔ32-121的PCR扩增:根据人PRNP基因序列设计引物,上游引入BamHⅠ,下游引入EcoRⅠ酶切位点(上游5′-TTGGCTGCTG GATG-3′,下游5′-GCGAATTCTCAT-
CCCACTATCAGGAAGATGA-3′);另外一对中间引物(上游5′-AGGCTTCGGGCG-3′,下游5′-TGGAGGATGGAACGGG-
TTGGCGGCTACATGCTG-3′)。PCR反应条件:94℃ 30s,63℃ 30s,72℃ 30s,共30个循环。PCR产物回收后与载体pMD18-T连接,(zeo+)真核表达载体,酶切及测序鉴定序列正确。
细胞培养及转染
SH-SY5Y细胞培养液为