文档介绍：从各种材料中提取DNA方法不同,分离提取的难易程度也不同。
对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易,多数病毒DNA 分子量较小,提取时易保持其结构完整性。
从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA 分子量较大,一般达2×10 道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA,除核DNA 外,还有质粒DNA 等。
1、核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶,DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、***仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时,先把DNP抽提出来,再把P除去,再除去细胞中的糖,RNA 及无机离子等,从中分离DNA 。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中,几乎不溶解, mol/L的***化钠溶解度最低,仅为在水中溶解度的1%,随着盐浓度的增加溶解度也增加,至1mol/L***化钠中的溶解度很大,比纯水高2倍。
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小,***化钠中溶解度较大。因此,在提取时,
常用此法分离这两种核蛋白。
细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方
法有三种:
①机械方法:超声波处理法、研磨法、
匀浆法;
②化学试剂法:用SDS处理细胞;
③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可
使细胞壁破碎。
由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中,所以提取时有两个困难(高等植物与此类似):
①破碎细胞难;从处死动物٠分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA 可能会被DN ase降解,而动物组织:特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝٠肾等组织也往往使用组织匀浆器,易造成DNA 断裂。
②分子量大,一般比细菌的大2—3个数量级,比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料,要根据具体情况选择适当的分离提取方法。
(1).浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M ***纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的***仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及***仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按***仿---异醇法除去蛋白.
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.
以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在***,,并称SSC溶液,提取DNA.
(2).阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.
(3).苯酚抽提法:
苯酚作为蛋白变性剂,,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.
( 4).水抽提法:
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,***%乙醇,% ٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,,,在提取过程中加入SDS.