文档介绍：基因工程需要三种不同的DNA: 全细胞DNA(总DNA, total cell DNA) 质粒DNA 噬菌体DNA
学****内容:
制备细胞总DNA
培养、搜集细菌细胞
制备细胞提取物
DNA纯化、浓缩
质粒DNA提取
根据分子大小分离
根据结构分离
质粒扩增
提取噬菌体DNA
噬菌体的培养、收集、纯化
纯化M13 DNA
基本步骤:
1) 培养、收集细菌细胞
2)打碎细胞,释
放内容物
3)去掉DNA以外
的成分
4)DNA溶液的浓缩
、搜集细菌细胞
两种类型的细菌培养基的成分:
M9培养基(确定成分培养基):g/L
Na2HPO4() KH2PO4() NaCl() NH4Cl() MgSO4() 葡萄糖() CaCl2()
LB培养基(不确定成分培养基) :g/L
typtone(10) 提供氨基酸以及肽段
Yeast extract(5) 提供氮源、糖类、有机和无机营养
NaCl(10)
、收集细菌细胞
37°C,150-250rpm培养10小时左右。
达到最大浓度2-3×109cell/ml。
600nm下的OD值,×109cell/ml 。
Harvesting bacteria by centrifugation
制备细胞提取物
利用溶菌酶、EDTA或两者结合。
溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中,能消化细胞壁的多聚物。
EDTA络合保持细胞结构完整的钙离子,也可以抑制DNA酶的活性。
提取液中同时还加入SDS,使细胞膜破裂,协助细胞壁的溶解。
Preparation of a cell extract.
Preparation of a cell extract
DNA的纯化
去掉DNA以外的成分
蛋白酶K/苯酚——蛋白质
RNA酶——RNA
Removal of protein contaminants by phenol extraction.
◆ Purification of DNA from a cell extract