文档介绍：安徽医科大学
硕士学位论文
弓形虫RH株速殖子cDNA文库的构建、免疫学筛选及阳性克隆鉴
定
姓名:王家传
申请学位级别:硕士
专业:病原生物学
指导教师:蒋作君;沈继龙
20050601
中英文词对照表英文缩写英文全称中文名称/缘三磷酸脱氧核糖二氨基联苯胺千道尔顿开放阅读框氨苄青霉索碱基对核苗大肠杆菌辣根过氧化物酶异丙基硫代.—§一话肴樘恰互补叩鉋安徽医科人学顺士学位论文瓻甤.‘·猤
中文摘要目的:构建弓形虫株速殖子文库并用慢性感染的小鼠血清对其进行免疫学筛选,以寻找有效的疫苗候选分子和早期诊断弓形虫病的试剂。方法:收集、纯化弓形虫株速殖予,提取总孀B忌蒭基因进行分析。结果:初始文库的容量为×鲋刈樽樱腥血清初筛了约×鲋刈榈氖删澹玫鲅粜钥寺。云渲个阳性克隆经过三次复筛,得到龀中粜苑从寺 Mü运母隹寺关键词:弓形虫文库免疫学筛选阳性克隆分析铣蒭础>炕盖小⒐バ∑魏螅隵噬菌体载体两臂连接包装后形成弓形虫株速殖子文库。收集成囊株株愿腥镜男∈笱G澹四の椒ㄈコ清中的大肠杆菌抗体,用以筛选弓形虫晁僦匙觘目狻6次复筛得到的阳性克隆进行插入片段的核苷酸序列测定,结果送同源性分析。根据序列测定结果,选取其中一个具有完整开放阅读框架的籅┰龊螅目獾牡味却啊痯/。任意挑取克隆经自身环化后提取质粒,酶切后片段大小范围为刈槁ヒ陨稀S每进行测序并经同源性分析发现,寺』蛭9纬鍼基因;寺基为弓形虫灰阴A姿岜亲R泼富颍籛克隆基因与现在已知的基因无同源性;克隆基因与一未知的弓形虫基因有很高的同源性,且具有一个笮〉耐暾目7旁亩量蚣埽ü云涞鞍字式峁购凸δ茉げ猓它可能是一个跨膜信号蛋白。结论:本试验成功地构建了弓形虫株速殖子文库,筛选所得到的阳性克隆有望成为早期诊断抗原或保护性疫苗分子,值得进一步研究。安徽医科大学硕士学位论文壬淼传
%—猚,琓.:
篢安徽医科火学硕士学位论文.:甋,.躨躳王截传
弓形虫是最常见的机会性感染原虫之一,常可导致严重的并发症甚至死亡弓形虫抗原的研究对寻找特异的诊断抗原,开发诊断试剂,以早期诊断和性和诊断性抗原方面作了不少研究,并取得了很大成绩。文库为提供与适当载体重组所形成的重组寺∪骸F渌牟迦牖蛱【,并且所含序列只含有既可被转录又能被翻译的外显子区。文库分弓形虫病是一种呈世界性分布的人兽共患性寄生虫病,弓形虫是广泛存在于细胞内的寄生原虫。免疫功能正常的人群感染后多呈无症状带虫状态,但在免疫功能受损的患者、免疫缺陷患者及先天感染者常导致严重后果⋯。弓形虫感染引起的临床类型多样,能使多种脏器和组织受损,如弓形虫性脑炎、弓形虫性视网膜脉络膜炎、弓形虫性腹膜炎等,严重者可导致死亡。孕妇感染弓形虫后,虫体可穿越胎盘屏障传入胎儿,影响其发育,严重者导致畸胎、死胎,存活者也常有畸形及智力发育不全等严重后遗症”“,同时,可使孕妇出现流产、早产或增加妊娠合并症;对于艾滋病患者,”捍送猓程ゼ倚笠彩艿酱瞬〉难现赝玻竽烈翟斐删薮笏鹗А。因此,弓形虫病的防治具有极其重要的意义,而目前尚无理想的防治方法。虽然血清免疫诊断是当前弓形虫感染实验室诊断的主要手段。匾煨院敏感性都不甚理想,而动物接种分离虫体的方法既费时又易漏检。因此,防治弓形虫病具有极其重要的作用。许多学者认为,研制廉价、安全、有效的弓形虫疫苗无疑是一个最好的防治措施。近年来,国内外在寻找保护进一步的从中筛选表达特异性功能抗原的克隆,并为表达相应抗原作为诊断抗原创造了条件,根据国内外的研究经验,保护性抗原分子的获得有多种途径,而从文库中筛选保护性的抗原分子编码基因是常用的手文库是以特定组织或细胞为模板,逆转录形成的互补异的反映了某种组织或细胞中,在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因把段之一Ⅲ。安徽医科大学硕士学位论文土家传
嚣苑⒂讨惺笨盏骺氐幕蚪刑卣鞣治觯《狙芯俊W表达文库⋯夜д呦陌返纫灿曛衅诔晒Φ毓菇斯纬株速殖子期表达文库““,后来的学者改进了构建方法并对其进行了工具,对其进行免疫学筛选及扩增目的基因才是构建文库的真正目的。筛选文库可用于:秆”;ば钥乖颍R呙绲难芯看蛳禄虫文库成功构建以来,已经筛选和扩增出了一批有价值的诊断抗原和在国内外一些实验室正在对筛选的抗原基因进行深入研究。一些学者还从筛选出表达弓形虫特异蛋白的克隆、获得高纯度的弓形虫特异的功能抗原,用以建立高度特异、敏感的分予免疫诊断方法,为提高免疫诊断的或慢性感染急性发作的病人。而对弓形虫慢性感染的研究具有更重要的意为表达型与非表达型两类,现已广泛用于下列工作:庠磂纳秆。方法简单,假阳性低:苯佑糜谖弈诤蛹羟凶饔玫囊栽讼赴泶铮蛄杏牖蜃楹怂嵝蛄斜冉希匀范ɑ虻哪诤忧胪庀宰