文档介绍：第三军医大学
博士学位论文
CPP及ER滞留信号在肿瘤治疗性肽疫苗中的修饰研究
姓名:王莉
申请学位级别:博士
专业:免疫学
指导教师:吴玉章
20040501
第三军医大学博士学位论文
及滞留信号肽在肿瘤治疗性多肽
疫苗中的修饰应用研究
摘要
现已证实肿瘤抗原特异性 CD8+ 细胞毒性 T 淋巴细胞(Cytotoxic T
Lymphocytes,CTL)在机体控制肿瘤中起重要作用因此有效激发特异性 CTL 应答是
当今肿瘤治疗性疫苗研究的一个重要目标 CTL 通过其 TCR 特异性识别抗原提呈细
胞(antigen-presenting cells, APC)(如肿瘤细胞)表面的主要组织相容性复合物(Major
plex MHC)- 类分子-抗原肽复合物自身得以活化并最终通
过多种机制杀死靶细胞这些与 MHC- 类分子结合的长度为 8–10 aa 的短肽被定义
为 CTL 表位(epitopes) 目前随着肿瘤特异性抗原及 CTL 表位的相继鉴定基于肿
瘤抗原 CTL 表位的多肽疫苗成为肿瘤治疗性疫苗研制的一个重要方向由于多肽疫苗
以氨基酸为原料可通过全自动化学合成手段大规模生产质控方便而且对于机体
相对安全因此受到人们的广泛重视并呈现出极大的发展空间但由于存在免疫原性
弱半衰期短及不易被 APC 摄取等问题使得多肽类疫苗应用于临床肿瘤治疗受到很
大限制为解决这些问题人们尝试了多种多肽疫苗修饰策略如对锚点氨基酸进行
置换添加脂类或多糖类基团等但在诱导特异性 CTL 效应方面仍存在一定不足
研究表明大多数与 MHC- 类分子结合的短肽来源于胞浆内合成的内源性蛋
白而外源性抗原如多肽类疫苗被 APC 以胞饮方式摄取后绝大多数进入 MHC- 类
抗原呈递途径以激活 CD4+Th 细胞仅有少量抗原以交叉呈递(cross-presentation)
的方式进入 MHC- 类抗原呈递途径因而不能有效激发 CTL 应答这也解释了为什
么内源性蛋白抗原比外源性可溶性抗原能更有效地激发抗原特异性 CTL 应答因此
在多肽类疫苗研制中探索有效的将外源性多肽抗原模拟内源性抗原的新型抗原传输
系统无疑具有重要意义
经典的 MHC- 类抗原呈递机制是存在于胞浆中的抗原被蛋白酶体降解成若干
短肽分子这些具有抗原性的短肽分子在抗原加工相关转运体(transporter associated
with antigen processing TAP)的协助下可从胞浆转运至内质网(endoplasmic reticulum
ER)腔内然后这些抗原肽再经过 ER 腔内的多种蛋白酶修剪最终成为适合与 ER 中
新合成的 MHC- 类分子结合的表位外源性抗原肽从胞外到胞浆再由胞浆到内质
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网的转运过程是两个至关重要的环节理论上若促进外源性抗原肽转运至 APC 胞浆
或 ER 腔则应增强抗原肽被 MHC- 类分子呈递的效率因此理想的外源性抗原
肽传输方式应该将外源性抗原肽靶向转运至胞浆或 ER
设想一将引入多肽疫苗的分子设计将多肽疫苗有效导入活细胞的胞浆
近年来在细胞生物基因治疗及药物体内转运等研究领域中兴起了对细胞膜通
透性肽(cell-rating peptides CPP)的研究热 CPP 属于小分子肽类长度为几个到
几十个氨基酸不等研究证实 CPP 可有效携带蛋白多肽 DNA 甚至颗粒性物质等
通过受体依赖或非依赖方式穿过大多数活细胞的质膜进入胞浆并在一定浓度范围
内对细胞无任何毒副作用目前已有多种蛋白来源的 CPPs 得到证实这些蛋白包括
果蝇的antennapedia 蛋白单纯疱疹病毒的VP22 蛋白及I 型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)
的 Tat 蛋白 Tat 蛋白是 HIV-1 的转录活化因子含 86-102 个氨基酸残基该蛋白可
自由穿过活细胞质膜并且整个蛋白或片段(第 37-72 位氨基酸)可定位于胞浆及胞核
研究表明 Tat 蛋白的碱性区(第 49-58 位氨基酸)对其实现细胞内在化起关键作用利
用来源于该蛋白碱性区的肽片段可将其它蛋白有效导入活细胞内功迄今为止研究
报道有数种长短不一的源于 Tat 的短肽显示出较强的穿膜功能其中最短的片段是
Tat49-57 我们设想若将 Tat49-57 与 CTL 表位直接连接可望借助 Tat49-57 的穿膜活性
将抗原肽直接带入细胞浆最终使其有效进入 MHC- 类抗原呈递途径
设想二将滞留信号肽引入多肽疫苗的分子设计促使多肽疫苗直接靶向
研究表明将 ER 转位信号肽直接连到蛋白抗原的 N 末端可使抗原以一