文档介绍：各种DNA提取方法提取方法提取方法提取方法
一,基因组DNA提取方法
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法,其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式:异硫***酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等
试验步骤: 1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液,(10mmol/LTris-%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀,50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次,2500rpm离心收集水相,用等体积的(酚,***仿,异戊醇)混合物抽提一次,2500r/min离心收集水相 6、用等体积的***仿,异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀,冰浴,10min.。 7、。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。 8、()与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。 9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。
二,外周血DNA提取技术
分离外周血白细胞提取方法: 试验步骤: 1、取人肘静脉血5ml,EDTA抗凝,2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆, 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液,摇匀,冰浴15min。 4、2500rpm离心10min,弃上清。 5、加入10ml 溶血液,摇匀,冰浴15min。 6、3000rpm离心10min,弃上清。 7、倒置离心管,去掉残液。 8、得白细胞,-80℃冻存。试验要求: 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h,4℃放置不超过5h,以防白细胞自溶。
三,***仿法抽提外周血白细胞基因组DNA:
试验试剂:Ligsisbuffer: 133mM NH4Cl ;最后加灭菌去离子水至1000ml,高压灭菌。ACD抗凝剂:;最后加灭菌去离子水至350ml,高压灭菌。提取缓冲液(Extractionbuffer):10mMTrisCl(PH=)(PH=)(PH=)(PH=)%SDS10%;最后灭去离子水至100ml, 高压灭菌试验步骤: 1、在500µl抗凝血中加入ligsisbuffer1000µl,充分颠混至清亮。以4000rpm,离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500µl,充分匀浆。以6000rpm,离心5min。 3、彻底弃去上清,加入e