文档介绍：致谢
深冬的杭州特别寒冷,今年特别难得的下了几场大雪。紫金港校区里树木凋零,草地枯黄,一片萧索的景象。尤其白雪覆盖下的紫金港,更是一年中最难得的景致,平添了几分风韵和魅力。转眼在美丽的紫金港已经生活了近八年,在即将离别的时刻,特别地留恋和不舍。在紫金港,我经历了从少年的青涩向成熟的过渡,特别是读研的这四年,是我人生中一笔巨大的财富。
首先我要感谢我的导师龚兴易近人就让我钦佩不已。 2007 年暑假,我非常幸运的拜在他的门下。读研期间,与龚者师的接触日渐增多,, 提醒着我要不断的学习来避免浅薄;龚老师孜孜不倦的工作,让我深切明白"一份耕耘,一分收获"的道理;龚老师的包容和温和,像润物细无声的春风,驱散了我心中的困惑和懈怠,激励着我前进。本文就是在龚老师的悉心指导下才得以完成的。从课题的选择,实验方案的设计,实验的操作到论文的撰写,无不浸润着龚老师的心血。师恩如海,衔草难报。在这里,我要给龚老师献上最诚挚的感谢,谢谢您,龚老师!
同时,我还要感谢一个人一一师母曾冬云高级工程师。她母亲般的关怀,一直温暖着我的心灵。
感谢周亮师兄,刚来实验室时带我做实验,引我入门;三年多来一直悉心指导我的学习和生活;学习之余一起去买菜做饭,一起参观博物馆以及一起去腐败等,让我时刻感受到实段室大家庭的温暖;尤其是本论文的究成,都得到他最直接的指导和帮助。
感谢即将毕业的汤甜甜,祝福她前程似锦,跟周师兄天天恩爱,早结连理。感谢邮剑勇师兄,一直给予我兄长般的关怀. 感谢秦勇和唐鸿云,在实验和论文修改过程给我的热情帮助和指导. 感谢陈福鼎,在我实验最需要帮助的时候,经常主动拉我一把,帮我走出困
境。这份同窗之惰,我会深刻铭记。
感谢吉鹏飞、王远鹏、马耕和戴唯在日常实验和论文修改时给予我的帮助。
感谢汪晨卉师姐、鲍文娜师姐、赖宗腾师凡、卢闽而师姐、倪源师兄、王智勇师兄、潘海峰师兄、张昕、王震、韩奇峰和姜燕对我的帮助。
感谢我的父母、姑姑、弟弟和表妹,感谢他们一直在我背后无条件的支持我, 鼓励我,让我可以在求是因深造。
感谢我的好友卢亿奇,在忙着自己毕业论文的同时,百忙之中抽空帮我修改论文。
感谢我的女朋友费佳燕,在我最艰难最需要关怀的日子里,一直不离不弃, 让我充满力囊,勇敢面对困难和挑战.
感谢所有关心我和支持我的人. 最后,感谢论文评审和出席答辩会的各位专家和老师!
潘翔
2011 年 3 月于生科院 344
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摘要
蛋白酶氨酸激酶(P丁K) 是具有酶氨酸激酶活性的一类蛋白质,能催化 ATP 上的。一磷酸基因转移到其它重要蛋白质的酷氨酸残基上,使其发生磷酸化,并介导细胞生长、分裂和信号传导等一系列生理生化反应. Src 家族激酶(SFKs)包括 Src 及其他八种蛋白,隶属于蛋白酶氨酸激晦。 Src 蛋白主要以两种形式存在: 病毒癌基因表达蛋白沪 Src 和细胞原癌基因表达蛋白 c-Src. c-Src 蛋白在细胞内参与信号传导,与细胞生长、分化、死亡等过程密切相关。目前,国内外对 Src 家族的研究大都集中在 c-Src 蛋白上,然而 c-Src 蛋白在体外活性低,导致对它的结构和活性无法深入研究。与 c-Src 蛋白间源的病毒 v-Src 蛋白,两者的结构与功能非常相似,且后者在体外活性基本不变。因此,本论文拟以大肠杆菌为宿主,大量表达重组协 Src 蛋白,并以此建立体外抑制 Src 活性药物筛选体系。
首先,利用实验室保存携带 v-s町基因的 pFastbac Htb 质粒 PCR 扩增目的基因,经克隆载体 pUCm-T 连接至表达载体 pGEX-KT 构建表达质粒 pGEX-KT/v-src ,经 PCR 、双酶切、测序鉴定其序列正确,转化大肠杆菌 BL21(DE匀。其次,构建好的工程菌株经正交实验优化诱导条件,确定最佳的表达条件为 、 1 mM IPTG 和 5h 诱导时间。在该诱导条件下协 Src 蛋白以包涌体形式大量表达,包漏体经洗涤、溶解、 GS丁亲和层析并经凝血酶酶切后,再经过尿素连续梯度透析复性后,获得有一定活性的 v-Src 蛋白。再次,用重组的 v-Src 蛋白来筛选中药卒枝莲提取物(ESB) ,发现乙醇提取物对重组v-Src 活性具有抑制作用, HepG2 肝癌细胞活性同样具有抑制作用。
本研究利用大肠杆菌表达系统获得了具有活性的 v-Src 蛋白,并利用其筛选出中药半枝莲的抑制 v翩翩 Src 活性、抗肿瘤成分,这为进一步研究 Src 蛋白的结构和功能以及构建体外抗肿瘤药物筛选系统奠定基础.
关键词:酷氨酸激酶活性, v-Sr