文档介绍：大连理工大学
博士学位论文
辽宁碱蓬甜菜碱合成酶基因克隆及转基因烟草耐盐性研究
姓名:李秋莉
申请学位级别:博士
专业:生物工程
指导教师:安利佳
20020501
辽宁碱蓬甜菜碱台成酶基因克隆及转基因烟草耐盐性研究
摘 要
甜菜碱是生物体内普遍存在的一种很有效的渗透调节剂。高等植物中,甜菜碱由胆
碱经两步酶催氧化得到,即:胆碱一甜菜碱醛一甜菜碱,催化第一步反应的酶是
胆碱单加氧酶【choline monooxygena se,CMO),催化第二步反应的酶是甜菜碱醛脱氢酶
(betaine aidehyde dehydrogenase,BADH)。辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis Kitag) 是一种耐盐性很强的盐生植物,本文对其甜菜碱、甜菜碱合成酶、甜菜碱合成酶基因进行了较为系统的研究。
,低于盐吸,高于
已测定的其它植物中的含量。通过硫酸铵分级沉淀、离子交换扣凝胶过滤层析相结合的方法,将辽宁碱蓬甜菜碱
醛脱氢酶分离纯化为电泳纯,纯化倍数为206倍,比活达到2363nm01/min·mg。辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶分子量为129kD,,表明其为同型二聚体。,,最适温度为30。C。在25℃和pH , 于甜菜碱醛的米氏常数L为6 “mol/L,最大反应速率%。。“mol/min。K+、Na+、 ca“、№“对酶活性均有很大的影响。
用RT—PCR并口RACE技术获得了辽宁碱蓬的CMO和BADH cDNA全序列。CMO cDNA全长 1820 bp,5 7端非编码区123 bp,3 7端非编码区368 bp,合有2个可能的加poly(A) 信号:AATTAA、AATAA,开放阅读框架1 329个核苷酸,编码一个由442个氨基酸构成的多肽,与菠菜、甜菜、山菠菜CMO的氨基酸序列同源性分别为77%、72%、74%,其中含有成熟肽链起始区“AVA”,具备Rieske—type[2Fe—s]蛋白的保守Cys-His对——“CTH”和“CPYH”,包括保守的多铁原子核结合域“DNYLD”和“HVPYAH”。BADH eDNA全长1 901 bp,5’端非编码区66 bp,3’端非编码区329 bp,含有2个可能的加polyA信号:AATAA, 开放阅读框架1 506 bp,编码一个由501个氨基酸构成的多肽,与菠菜、甜菜、山菠菜 BADH的氨基酸序列同源性均为88%,其中有醛脱氢酶的保守序列VTLELGGKSP和半胱氨酸残基。
分别克隆了CMO、BADH基因的编码区,构建了它们的植物表达载体pBll21一CMO和
pCAMBIAI 301一BADH,冻融法将质粒分别导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
LBA4404,获得工程菌LBA4404一pBll2I-CMO和LBA4404一pCAMBIAl301一BADH。
农杆菌介导法将CMO和BADH基因分别导入烟草(Nictiana tabacum ),获
得卡那霉素抗性和潮霉素抗性植株,PCR和Southern杂交均证明外源CMO和BADH基因
丈连理工大学博士学位
已整合到烟草基因组中。转基因烟草的甜菜碱含量明显高于对照,转基因烟草叶片膜相对电导率明显低于对照,说明盐胁迫下转基因烟草的膜结构所受损伤小于对照。转基因烟草具有一定的耐盐性,%NaCl的培养基中正常生长,转BADH %NaCI的培养基中正常生长,%NaCI的培养基中即停止生长。
关键词: 辽宁碱蓬,胆碱单加氧酶,甜菜碱醛脱氢酶,基因克隆,转基因烟草,耐盐性
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Betaine is a very effective osmopretectant existed in higher plants, betaine is synthesized by a two-step oxidation of choline:choline—betaine aldehyde— first step is catalyzed by choline monooxygenase(CMO).The second step is catalyzed by betmne aldehyde dehydrogenase( Iiaotungensis Kitag is a halophyte w