文档介绍：第三军医大学
博士学位论文
HIF-1与线粒体呼吸链的关系及对细胞糖代谢的影响
姓名:徐世伟
申请学位级别:博士
专业:外科学(烧伤)
指导教师:汪仕良
20040501
第三军医大学博士学位论文
HIF-1 与细胞线粒体呼吸链的关系
及对细胞糖代谢的影响
摘要
目的
1 研究线粒体呼吸链和 ATP ROS 等对 HIF-1 的稳定积聚的影响
2. 探讨缺氧时 HIF-1对 Glut-1和 GK 及 ATP 产生的影响
材料和方法
大鼠肝 BRL细胞以 DMEM 培养基加小牛血清培养分别分为正常对照组(21
O2)(常氧组) 缺氧组(1 O2) 各常氧和缺氧加阻断剂组(碘乙酸鱼藤酮抗霉素
A 叠氮钠 2,4-二硝基苯酚) 常氧和缺氧分别加 ATP H2O2 谷胱甘肽组常氧加
吲哚美辛组缺氧组和缺氧加吲哚美辛组缺氧 4h 收获细胞分别行 Western Blot 检
测各组的 HIF-1 Glut-1和 GK 蛋白荧光检测二乙酸二氯荧光素测定各组的细胞
内 ROS 产生高效液相色谱法检测 ATP 和能荷免疫荧光法检测细胞内 HIF-1 的
表达和核转位 RT-PCR检测各组的 Glut-1和 GK 的 mRNA含量酶学方法检测 GK
的活性
结果
分别于常氧(21 O2)和缺氧(1% O2)条件下以由低到高不同浓度鱼藤酮抗霉素和
叠氮钠阻断线粒体呼吸链复合体 I III 和 IV 4h Western Blotting 检测 HIF-1á 蛋白,
结果表明缺氧时随各阻断剂浓度的增高细胞内 HIF-1á 蛋白量逐渐减少到基本无
表达常氧情况下阻断线粒体呼吸链复合体 I III 和 IV 与未阻断一样无 HIF-1á
蛋白稳定积聚
与常氧(21 O2)对照组相比缺氧(1 O2)4h时细胞 ATP 和能荷明显降低常氧
下采用碘乙酸阻断糖酵解或分别以鱼藤酮抗霉素和叠氮钠阻断呼吸链复合体I
III IV 4h 细胞 ATP 和能荷较对照组明显降低缺氧时采用碘乙酸阻断糖酵解或分
别以鱼藤酮抗霉素和叠氮钠阻断呼吸链复合体I III IV 4h 细胞 ATP 和能荷均
较单纯缺氧明显降低
常氧情况下细胞有一定的 ROS 产生缺氧 4h 时细胞的 ROS 产生减少缺氧并
应用碘乙酸阻断糖酵解或分别以鱼藤酮抗霉素和叠氮钠阻断呼吸链复合体I III
IV 4h 细胞 ROS 产生更加减少
Western Blot 检测 BRL 细胞常氧下 HIF-1 仅微量表达,检测呈阴性缺氧 4h
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时其表达明显增加缺氧同时以不同的浓度碘乙酸阻断糖酵解 BRL 细胞的 HIF-1
产生稳定与单纯缺氧相比较无明显改变在常氧(21 O2)和缺氧(1% O2)条件下应用
2,4-二硝基苯酚使氧化磷酸化解藕联 BRL 细胞 ATP 和 ROS 产生减少常氧(21 O2)
时应用 2,4-二硝基苯酚低浓度时对 HIF-1 无影响高浓度时可诱导 HIF-1 的稳定
积聚在缺氧(1% O2)条件下低剂量应用 2,4-二硝基苯酚使 HIF-1 产生被抑制高
剂量时 HIF-1 的产生增加在常氧(21 O2)和缺氧(1% O2)条件下分别在细胞培养液
中加入 H2O2 ATP 和谷胱甘肽对 HIF-1 产生无明显影响
免疫荧光检测表明常氧(21 O2)时细胞有微量 HIF-1 表达并核转位缺氧(1%
O2)时 HIF-1 的稳定积聚增加并大量核转位缺氧(1% O2)时应用吲哚美辛抑制 HIF-1
稳定积聚细胞内 HIF-1 含量和核转位明显减少
RT-PCR 检测表明单纯缺氧(1% O2)BRL 细胞内 Glut-1 和 GK 的 mRNA 较常氧
(21% O2)时明显增加 Western Blot 检测表明单纯缺氧(1% O2)BRL 细胞内 Glut-1 和
GK 蛋白量较常氧(21% O2)时明显增加缺氧(1% O2)时以吲哚美辛抑制 HIF-1 稳定
积聚后 Glut-1 和 GK 的 mRNA 增加受抑制缺氧(1% O2)时以吲哚美辛抑制 HIF-1
稳定积聚 4h 后 Glut-1 和 GK 蛋白增加受到抑制缺氧(1% O2)后 GK 活性明显增强
缺氧(1% O2)时以吲哚美辛抑制 HIF-1 稳定积聚 4h 后 GK 的活性较单纯缺氧对照组
降低缺氧(1% O2)时 BRL 细胞 ATP 产生减少缺氧(1% O2)时以吲哚美辛抑制 HIF-1
稳定积聚 4h 时 ATP 较对照组降低
结论
1. 在大鼠肝细胞(BRL) 细胞单纯缺氧时 HIF-1 积聚和稳定反应