实验三 单核苷酸多态性的检测.ppt

文档介绍：实验五单核苷酸多态性的检测
一、实验目的
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单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs)是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变异所引起的DNA序列多态性。
在一个群体中,当基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同核苷酸且出现频率大于1%(也有人提出2%)时,被视作SNP。由于这种界标数目极多,覆盖密度大,由此可以大大提高基因组作图和基因定位的精度。

变性高效液相色谱(DHPLC):高效、快速、高灵敏度、低成本、全自动化操作
基于凝胶电泳的限制性片段长度多态性(RFLP)
等位基因特异的寡核苷酸杂交(ASO)
单链构象多态性(SSCP)分析
以荧光共振能量传递为基础的Taqman法
DNA芯片、质谱法、微测序法等。
CEL1酶(环球基因公司,Transgenomics, Inc.) 能识别单碱基错配,也被应用于SNP的检测。
3. SNPs检测在分子遗传学中的应用Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING)
反向遗传学
定做突变体
收单株,各自提DNA
如果PCR产物经变性复性后有错配的碱基对(也就是说有人们想要的突变体):
酶切结果会提示
组织化,用户只需提交想研究的基因的引物序列
4. 本实验原理
本实验利用聚丙烯酰***电泳,观察拟南芥不同生态型中某基因片段的SNP。根据测序结果,拟南芥不同生态型Ws和Col的At5g62130片段分子量大小相同,但存在单一位点的差异,而这种差异用常规的琼脂糖凝胶电泳无法区分。
在实验中,首先利用PCR扩增拟南芥At5g62130片段基因。然后对PCR产物进行变性和复性后,进行聚丙烯酰***凝胶电泳分离。由于SNPs的存在,Ws、Col 及Ws和Col杂交F1代中At5g62130扩增片段经变性和复性后,因其构象不同,故可根据其泳动速率的差异而加以区分。
Fig.  Typical band patterns of duplex analysis markers of different loci.
Generation of co-dominant PCR-based markers by duplex analysis on high resolution gels
The Plant Journal 1998, 16 ( 1): 117
三、实验材料与试剂
:C0,Ws;
:100mM Tris-Cl (pH ), 20mM EDTA (pH ), NaCl, 2% (w/v) CTAB
3.***仿、异丙醇、75%乙醇,无菌水等;
、PCR反应试剂,包括PCR buffer、dNTP 、Taq酶等。
%聚丙烯酰***凝胶、DNA上样缓冲液、DNA分子量Marker、TBE电泳缓冲液、EB染色液等。
四实验步骤
采用CTAB法提取不同生态型(C0、WS)拟南芥基因组DNA。
1)取1~2株小苗,加入50l预热CTAB提取液,在离心管中用玻棒磨成匀浆,再加入350l CTAB溶液,继续研磨。65º。
2)冷却至室温后加入等体积***仿400l,上下颠倒混匀,12000rpm,离心10min。吸取上清,移入另一管中。
3)加入1ml预冷的无水乙醇,混匀后-20ºC放置15min。12000rpm,离心15min。
4)倒去上清,沉淀用1ml 75%乙醇清洗,略离心后,小心倒去上清,将沉淀空干。
5)用20l H2O或TE缓冲液溶解沉淀。