文档介绍：实验三 Trizol法提取细菌总RNA
一、实验原理
Trizol主要物质是异硫***酸胍,它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时,保护RNA的完整性。加入***仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≧1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
主要试剂和器材
Trizol 溶液***仿异丙醇 75%乙醇 % DEPC水超净工作台 mL离心管无Rnase移液枪紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌
实验步骤
一. 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA
挑取大肠杆菌菌单菌落培养至稳定期取菌液 mL mL离心管离心得菌体 2、每管加入 1 mL Trizol 溶液盖紧管盖激烈振荡15 s室温静置5 min 4℃12000 g离心 10 min取上清转入(约 1 mL)新的 m L离心管中
每管加入 mL 的***仿( 体积 Trizol)盖紧盖剧烈振荡 15 s室温静置 3 min4℃, 12000 g, 离心10 min, 离心管,测量其体积,加***仿时应充分震荡使其充分乳化。
加入1倍体积的***仿,盖紧盖,剧烈振荡15 s,室温静置 3 min,4℃12000 g离心 10 min小心吸取上层水相,转入另一已编号新的 离心管。
加入 mL 的异丙醇( 体积 Trizol)轻轻颠倒混匀,室温静置 10 min,4℃12000 g离心 10 min,RNA 沉于管底,小心吸去上清
6、加1 mL75%的乙醇(预冷),并轻柔颠倒,洗涤沉淀4℃7500 g离心 5 min,小心弃上清,微离吸去剩余乙醇,室温干躁 10 min。
各管用 30μL DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解,55-60℃温育5 min,分装,-80℃贮存(可贮存5周)。
二. RNA 浓度的测定
取 10 µL RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中,小心排除气泡,以等体积的双蒸水作为空白对照。在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm的光吸收值。根据公式计算 RNA 的浓度。
RNA 浓度(µg/µL)= OD260 × 稀释倍数(200)× 40(µg/mL)/1000
纯 RNA 样品的 OD260/OD280 比值为 ~若低于该值,表明存在蛋白质污染,可重新用酚∕***仿抽提。该值为 时RNA 纯度为最高。
三. RNA 质量检测
将 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测,目的在于检测 23 S 和 16S 条带的完整性和它们的比值。一般认为如果 23 S和16 S 条带明亮、边缘清晰并且23 S的亮度在 16 S 条带的两倍以上则 RNA的