文档介绍：生物选修3知识点总结
《专题1   基因工程》
基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,又叫做DNA重组技术。
基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)
(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。
(3)结果:经限制酶切割产生的DN***段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。
(4)注意:①一般用两种限制酶同时切割载体(质粒)和目的基因,意义在于:防止目的基因自身环化以及目的基因反向连接到质粒。
②选取限制酶酶切时,需要避免限制酶损坏目的基因的完整性和标记基因(抗生素抗性基因)。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较:
①相同点:都缝合磷酸二酯键。
②区别:E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DN***段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较低。
DNA连接酶与DNA聚合酶的 异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DN***段的末端,形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体
(1)载体具备的条件:①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点,供外源DN***段插入。
③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
(3)其它载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒
(二)基因工程的基本操作程序
第一步:目的基因的获取
: 编码蛋白质的基因。
:自然界中已有的物种中分离(原核基因),真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。从基因文库中获取目的基因,含有一种生物所有基因的文库叫做基因组文库,只包含一种生物的一部分基因的文库叫做部分基因文库,例如:cDNA文库。(cDNA:某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DN***段)
(1)原理:DNA双链复制
(2)前提:已知目的基因的核苷酸序列。
(3)过程:第一步变性:加热至90~95℃DNA解链;第二步复性:冷却到55~60℃,引物结合到互补DNA链;第三步延伸:加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始互补链的合成。
第二步:基因表达载体的构建(基因工程的核心)
:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
:启动子+目的基因+终止子+标记基因
(1)启动子:是一段有特殊结构的DN***段,位于目的基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动目的基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。
(2)终止子:也是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的尾端。
(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。
第三步:将目的基因导入受体细胞_
:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
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将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
农杆菌转化法:农杆菌能在自然状态下感染双子叶植物和裸子植物,当植物受伤时,伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物,吸引农杆菌移向这些细胞,这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA上。
将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。利用显微注射技术将目的基因注入到受精卵内没有融合的雄原核中。
将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,最常用的原核细胞是大肠杆菌,其转化方法是:先用 Ca2+ (CaCl)处理细胞,使其成为感受态细胞,再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。
,筛选含有基因表达载体的受体细胞依据是