文档介绍：第三军医大学
硕士学位论文
NO提高放化疗措施对白血病细胞损伤效应的实验研究
姓名:张春雷
申请学位级别:硕士
专业:临床检验诊断学
指导教师:蒲晓允
20040501
第三军医大学硕士学位论文
提高化疗药物及射线对细胞损伤效应的实验研究

摘要

目的构建体外研究 NO 间接作用的模型观察此模型培养条件下 NO 能否提
高 L1210 细胞放化疗疗效探讨 NO 作用机制为临床白血病的治疗提供新的思路
材料和方法 1 实验材料 L1210细胞 3T3 细胞大肠杆菌DH5 -iNOS
质粒质粒及自制隔离培养器 2 实验方法质粒的转化抽提酶
切鉴定和转染按照分子克隆常规操作转染细胞鉴定的检测方法按照试剂操作说明书
进行 RT-PCR 免疫组化和 NO 含量检测 NO 对 L1210 细胞作用培养分组将
L1210 细胞加入隔离培养器内培养 12 孔板内分别接种质粒和空载体转染的 3T3 细胞
隔离培养器内外细胞培养液均为根据实验设计分为 NO 对 L1210 的作用 NO
提高 L1210 细胞放疗疗效及其机制和 NO 提高 L1210 细胞化疗疗效及其机制三大组
每大组根据 12 孔板内接种的转染细胞不同分为三组 -iNOS 转染 3T3 细
胞转染 3T3 细胞 -iNOS 转染 3T3 细胞加上终浓度为
100ummol/L 的 DEVD-CHO NO 提高 L1210 细胞放化疗疗效的检测方法收集
各组 L1210 白血病细胞 12 24 48 72h 的标本台盼蓝染色观察直接损伤的作用
收集各组 L1210 细胞 12 24 48 72h 的标本 TUNEL 法观察诱导细胞凋亡的情况
收集各组 L1210 细胞 4 8 12 24 48 72h 标本流式细胞检测细胞周期观察细胞
的增殖状态
结果 1 转染细胞的鉴定质粒鉴定质粒双酶切后电泳出现两条 DNA 带
第一条与空载体的 DNA 带相齐第二条与人 iNOScDNA 片段大小一致
质粒分别以 T7 和 BGH 作正反两个方向送上海申友公司测序测序结果与 Genebank
上吻合 RT-PCR 鉴定转染细胞 RT-PCR 扩增产物电泳显示 PCR 反应时质粒转
染组扩增出约 600 的 DNA 带与根据人 iNOS 基因设计引物的目的片段大小一致
而对照组和空载体转染组未扩增出相应的 DNA 带免疫组化结果对照组和空
-iNOS 转染组在3T3 细胞内有黄绿色的iNOS
蛋白培养上清 NO 含量质粒转染组比空载体转染组和对照组 NO 的含量在每
个时相点都显著增高(P<) 载体转染组和对照组 NO 的含量在各个时相点没有显著
差异(P>) 2 NO 对 L1210 细胞的作用及其机制 NO 对 L1210 细胞的直接损
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伤作用 24h 开始质粒转染组 L1210 细胞台盼蓝拒染率比空载体转染组显著下降
(P<) DEVD-CHO 在 48h 有显著的逆转作用(P<) 细胞凋亡检查结果
质粒转染组较空载体转染组 L1210 细胞凋亡率 12h 有显著的增加(P<) 24h 开始细
胞凋亡率有非常显著的差别(P<) 加 DEVD-CHO 细胞凋亡率下降 24h 开始与质
粒转染组有显著的差异(P<)3 NO 提高 L1210 细胞化疗疗效及其机制研究 NO
对 12Gy 照射后 L1210 细胞直接损伤作用的影响各组 L1210 细胞台盼蓝拒染率随时
间的延长而减低质粒转染组 L1210 细胞下降更快 12h 开始有显著差异(P<) 72h
有特别显著性差异(P<) 质粒转染组加 DEVD-CHO 能够提高台盼蓝拒染率 24h
开始有显著的差异(P<) NO 对 12Gy 照射后诱导 L1210 细胞凋亡的影响射
线照射后 L1210 细胞凋亡率持续上升质粒转染组 24h 开始细胞凋亡率明显升高与
空载体转染组细胞凋亡率相比有显著差异(P<) 质粒转染组加 DEVD-CHO 细胞凋
亡率有所下降 24h 开始与单独质粒转染组有显著的差异(P<) NO 对 12Gy
照射后 L1210 细胞周期的影响射线照射后质粒转染组 L1210 细胞 G1 期升高更快
4h 与空载体组相差显著(P<) 8h 12hG1 期升至高峰两组无明显差异(P>)