文档介绍：细菌总DNA(total DNA, genomic DNA)提取和凝胶电泳检测
总DNA(total DNA, genomic DNA)凝胶电泳
2. 学****琼脂糖凝胶电泳方法关键词:电泳凝胶细菌细菌总DNAtotalDNAgenomic提取凝胶电泳
基本概念:
总DNA(total DNA, genomic DNA)凝胶电泳
[实验目的]
2. 学****琼脂糖凝胶电泳方法
[实验材料]
自己分离纯化后的细菌菌株
TE、溶菌酶溶液(20mg/ml)、10% SDS、蛋白酶K(20mg/ml)、5mol/L NaCl酚:***仿:异戊醇(25:24:1)、乙醇
3. 仪器
高速台式离心机、紫外检测仪
4. 其他材料:离心管、无菌吸头、移液器等
[实验步骤和过程]
(一)细菌总DNAD 提取
革兰氏阳性菌DNA提取方法(提取基因组DNA)
1. 3-6ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 弃上清
2. TE悬浮沉淀,并加75μl 溶菌酶(20mg/ml)溶液,40°C保温30分钟
3. 加50μl, 10% SDS, 5μl 蛋白酶K (20mg/ml),混匀, 37℃保温30分钟
4. , 5mol/L NaCl, 混匀
5. 用等体积酚:***仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管
6. 用等体积***仿:异戊醇(24:1)抽提, 静置10分钟,5000转离心10分钟,转移上清到干净管中。
7. 加2倍体积乙醇沉淀DNA, 颠倒混合, 室温下静止10分钟,离心沉淀DNA
8. 70%乙醇漂洗DNA后, 吸干, 用30-50μl TE溶解DNA, -20℃保存
革兰氏阴性菌总DNA提取方法
方法一:
1. ( Nacl, Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶,pH=8).
2. 37℃温浴2h,
3. 10%SDS( Nacl, Tris,10%SDS,pH=8)反复颠倒混匀10min,10000r/min离心10min,取上清
4. 用等体积苯酚:***仿:异戊醇各抽提1次,水相中加入40μl的3mol/l乙酸铵和3ml无水乙醇,-20℃沉淀DNA1h,12000r/min 离心10min
5. 收集DNA沉淀,用100μl TE溶解
方法二:
1. 加入DNA提取液100 mmol/l,(Tris100 mmol/lEDTA,100 mmol/lNacl,1%pvp , 2%SDS,pH=8)旋涡混匀
2. 在摇床上250 r/min振荡2h,4℃沉淀DNA 1 h,13000 r/min离心10min收集DNA 沉淀
3. 用100μlTE溶解DNA
方法三:
(100 mmol/l,Tris100 mmol/lEDTA,100 mmol/l磷酸钠, Nacl,1%CTAB,pH=8),20μl蛋白酶K(20mg/ml)和500μl溶菌酶(