文档介绍：原位杂交
In situ hybridization (ISH)
王海龙
肺泡巨噬细胞TGFβ1原位杂交染色DAB× 200
支气管上皮细胞TGFβ1原位杂交染色DAB× 200
第一节原位杂交概述
一、概念
原位杂交组织(或细胞)化学技术简称原位杂交(In situ hybridization),属于固相核酸分子杂交的范畴。是应用已知碱基序列并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸( mRNA )按碱基配对的原则进行特异性结合,形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,在核酸原有的位置进行细胞定位和定量。
二、原位杂交与其他杂交技术的区别
菌落杂交:细菌裂解释放出DNA,然后进行杂交;
Southern杂交:是鉴定DNA中某一特定的基因片段;
Norhtern印迹杂交:是检测某一特定的RN***段的。
它们都只能证明细胞或组织中是否存在待测的核酸,而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位和数量。
三、原位杂交的历史
1969年美国耶鲁大学Gall 和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交,确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。
同时,Nardelli、John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位,从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。
第二节原位杂交技术
一、杂交前准备
(一)DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水
DEPC即二乙基焦碳酸酯,可灭活各种蛋白质,是RNA酶的强抑制剂。
原则上在杂交及其以前的步骤中,所有液体试剂均需用DEPC处理,或用DEPC水配制,包括乙醇的稀释。此外,接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。
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注意:①DEPC是一种潜在的致癌物质,在操作中应尽量在通风的条件下进行,并避免接触皮肤。②含有Tris缓冲液的溶液中,不能加入DEPC。