文档介绍：博士学位论文
Bad来促进细胞的生存。Bad是Bcl—2家族中的一个促凋亡蛋白,-亡(Apoptosis)。地能直接使Bad与胞质中的蛋白螯合,,,恢
复抗细胞凋亡的功能。最近的研究提示,,众所周知,p53是经典的抑癌基因,,促进其降解,]p53的功能,从而进一步影响细胞周期的进行,,因此推测 P13K/Akt/。众多的研究表明,P13K/Akt通路在多种恶性肿瘤组织中被激活及过表达,诸如胃癌、乳腺癌、胰腺癌等,P13K/Akt通路能够抑制许多肿瘤抑制蛋白的表达,诸女1]Bad,FOXO 转录因子等,Akt可以通过磷酸化作用活化Bad,,,因此,阻断P13K/Akt通路可能对于抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡有重要意义。在关于乳腺癌、前列腺癌的研究中表明,p66Shc 参与了细胞的线粒体介导的细胞凋亡过程,多数报道认;)kgp66Shc通过氧化应激过程参与了肿瘤细胞抗凋亡过程,在我们的前期实验中表明,p66Shc有促进结直肠癌细胞增殖及抗凋亡作用, 蛋白家族、蛋白水解酶存在相关关系,因此提出假说考虑p66Shc的通过P13K/ Akt/。在我们的实验研究中,首先检测验i正Tp66Shc在结直肠癌组织及结直肠细胞株中的表达水平,其次通过干扰其表达进一步研究p66Shc沉默后对结直肠癌细胞的增殖、凋亡的影响,最后检测P13K,Akt,,旨在探讨p66Shc对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响及信号调控通路的调控机制,为临
床干预进展期结直肠癌的增殖、凋亡提供理论实验基础。
研究方法
III
万方数据
摘要
采用实时定量PCR技术(RT-PCR)与免疫印迹(Western blot)技术检测 30例结直肠癌组织和癌旁组织中p66Shc的表达。检测细胞株(NCM460、 HCT8、HCTll6、SW620、CaC02)中p66Shc的表达水平。(NCM460是正常结肠上皮细胞,其余四株是结直肠癌细胞)。 (1)利用生物信息在线网站Ambion、Genesil、Genecard设计RNAi序列。(2),运用RNA干扰技术沉默HCT8中的p66Shc 的表达。
(3)RT-PCR、Western blot技术检测干扰效果。 、凋亡的影响(1),检测干扰p66Shc对HCT8细胞增殖的影响。(2)运用流式细胞技术AnnexinV-FITC方法,检测干扰p66Shc对HCT8细胞凋亡的影响。
(1)干扰p66Shc对结直肠癌细胞中凋亡相关蛋白的影响
运用Westem blot法检测HCT-、 、Bax、。(2)
运用Western blot法检测干扰后p-P13K、P13K、p-AKT、AKT、p-Mdm一2、
p53表达变化。
-8细胞周期的影响
。定量数值采
用均数士标准差(standard deviation,SD)表示。其中组织的RT-PCR结果△Ct 的比较采用配对样本t检验( t text)。实验过程中RT-PCR实验结果采用单因素方差分析( ANOVA)K-8体外增
IV
万方数据
博士学位论文
殖实验采用方差分析和单因素方差分析法进行分析。所有统计学结果P< 为差异有统计学意义。
研究结果 、生长有关(1) 实时定量PCR技术(RT_PCR)检测结果显示30例结直肠癌组织中 p66Shc的表达高于癌旁组织(P<)。
(2) 实时定量PCR技术(RT_PC