文档介绍：第三军医大学
硕士学位论文
VEGF165转染真皮多能干细胞及其对放创复合难愈性创面促愈的
实验研究
姓名:刘志君
申请学位级别:硕士
专业:军事预防医学
指导教师:徐辉
20040501
第三军医大学硕士学位论文
转染真皮多能干细胞及其对放创
复合难愈性创面促愈的实验研究

摘要

放创复合伤多见于战时核爆炸和平时核事故损伤后其伤口愈合主要表现为愈合
过程的延迟甚至长期不愈合尽管促进难愈性创面愈合的方法很多如手术植皮人
工皮片应用敷料促愈法全身或局部药物应用细胞因子局部应用等等但已有的
方法和措施尚存在应用上的局限性如手术植皮中自体或异体皮来源的困难细胞因
子局部应用疗效受到药物半衰期短的影响这迫切要求人们寻找促进放创复合难愈性
创面愈合的新措施与新方法
近年来随着细胞生物学和分子生物学的迅猛发展创面难愈的机理研究取得
了一些进展目前的研究结果表明引起创面难愈的原因主要有由于局部组织
严重受损导致局部的血液供应差难以提供充足的营养以满足局部组织细胞再生修
复的需要导致创面迁延不愈局部组织细胞损伤严重致使创面局部残留的修复
种子细胞数量少功能障碍或低下创面多种细胞生长因子的缺乏或降低直接影
响到局部修复细胞的分裂与增殖以及新血管生成困难随着干细胞组织工程学的发展
干细胞移植应用为解决放射损伤后创面修复细胞数量减少和功能降低所导致创面难愈
提供了新的思路基因治疗是目前创伤促愈的重要方法之一利用转基因干细胞移植
不仅为创伤局部提供足够的修复种子细胞而且目的基因的高效表达可弥补难愈性创
面局部存在细胞生长因子的缺乏或降低有望发展成为一条非常有前途的促进难愈性
创面愈合的新途径
真皮多能干细胞是我室新近成功分离培养的一类中胚层来源的具有多向分化能力
的干细胞初步研究表明这种真皮多能干细胞对创伤局部微环境的反应性明显强于成
纤维细胞血管内皮细胞等其它修复细胞是参与皮肤创伤愈合的一种重要的组织修
复细胞且易于培养扩增可扩增多代而不丧失其多向分化能力在本实验中我
们发现它对携带目的基因的质粒载体易感能高效表达目的基因是细胞基因治疗的
良好载体因而真皮多能干细胞不仅可作为构建组织工程化皮肤的理想种子细胞用于

*本研究受国家重点基础研究发展规划项目(973 项目 G1999054205)
及全军十五医药卫生基金项目(01MA166)共同资助
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第三军医大学硕士学位论文
大面积皮肤缺损的处理而且可作为基因转染的载体细胞用于基因治疗及某些疾病发
病机制的研究 VEGF165 是血管内皮细胞生长因子家族中生物学功能最强的一个蛋白
异构体是一种分泌性糖蛋白扩散力强易于到达靶细胞对血管内皮细胞的迁移
增殖生长具有重要的促进作用并可促进成纤维细胞的增殖迁移刺激局部修复
细胞聚集在伤口部位合成和分泌细胞外基质成分具有强大的促创伤愈合作用鉴
于上述原因我们利用真皮多能干细胞的自我复制能力与多向分化潜能将带有增强
型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein, EGFP)标记的真核表达的双顺反子
质粒载体 pIRES2-EGFP-VEGF165 转染入真皮多能干细胞并将其扩增后局部移植入
放创复合伤创面观察其对放射损伤创面的促愈作用探讨促进难愈性创面愈合的新
途径和方法主要结果如下
1 成功构建了真核表达的双顺反子质粒载体 pIRES2-EGFP-VEGF165
提取 HL-60 细胞的总 RNA 利用设计的 VEGF165 特异性引物通过 RT-PCR 技
术扩增出 VEGF165 cDNA 琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收纯化插入克隆载体
pMD18 T vector 并将其转化入工程菌 DH5á 扩增后提取质粒用 EcoRI 与 BamHI 双
酶切重组克隆载体并测序分析获得与 Gene Bank 报道序列一致的 DNA 片段将所
获得的正确片段进行琼脂糖凝胶电泳回收后插入真核表达载体 pIRES2-EGFP 的多克
隆位点同样转化工程菌 DH5á 后扩增提取质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定获
得的片段与正确片段大小一致
2 顺利将 pIRES2-EGFP-hVEGF165 转染入真皮多能干细胞
运用脂质体转染的方法将重组质粒 pIRES2-EGFP-VEGF165 转染入真皮多能干
细胞转染后的细胞经 G418 筛选转染后的真皮多能干细胞用半定量 RT-PCR 可检
测出其 VEGF165 表达扩增产物插入 pMD18 T vector 测序鉴定与 Genebank 比较完
全一致且其表达产物与转染空载体细胞相比较转染 VEGF165 细胞 VE