文档介绍：一、原理
使用一对沙眼衣原体特异性引物和一条沙眼衣原体特异性荧光探针,配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTPs)等成分,用PCR体外扩增法检测沙眼衣原体DNA。
二、标本的采集和处理:
:生殖泌尿道分泌物
:
男性:用男性专用棉拭子取尿道分泌物或伸入尿道约2~4cm,略捻拭子取出分泌物
(略带粘膜),拭子取出后放入塑料试管密闭送检。
女性:
***-用无菌生理盐水洗去宫颈外分泌物,再用女性专用棉拭子插入宫颈内,停留5秒后旋动棉拭子采取宫颈分泌物,密闭送检。
尿道-棉球蘸取无菌生理盐水洗净尿道口,再用女性专用棉拭子插入尿道约2cm,略捻拭子取出分泌物(应略带粘膜),密闭送检。
:门诊病人标本由患者本人送检,住院病人标本由专门工作人员运送。标本可立即用于测试,1~5℃保存不超过3天,也可保存于-20℃待测,保存期6个月。
三、试剂
。
:
组分名称
规格
数量
PCR反应管
1人份/管
20
DNA提取液
500µl /管
2
阴性质控品
250µl/管
1
CT临界阳性质控品
50µl/管
1
CT强阳性质控品
50µl/管
1
CT阳性定量参考品(×104~× 107 IU/ml)
10µl/管
4
:于-20℃保存,避免反复冻融。试验前室温平衡30min。
四、仪器:
高速低温离心机,生物安全柜,恒温金属浴,Roche 。
五、操作步骤:
(一)核酸提取:
1标本处理:
标本试管中加入1ml无菌生理***化钠溶液,充分震荡混匀;
,12,000rpm离心5min;
去上清,沉淀加无菌生理***化钠溶液1ml,漩涡振荡器混匀,12,000rpm离心5min;,沉淀中加入50µlDNA提取液充分混匀,100℃恒温干浴10min(误差不超过1min)
12,00rpm离心5min,备用。
2 阴性质控品的处理
取出阴性质控品,复温至室温后吸取50µ,加入50µlDNA提取液,振荡器混匀5~10秒,1OO℃干浴10min(误差不超过1min)
12,000rpm离心5min,备用。(在二区进行)
3 CT临界阳性质控品的处理(同阴性质控品)
4 CT强阳性质控品的处理(同阴性质控品)
(二)PCR扩增:
1 加样:取PCR反应管,分别加入待测标本及阴阳性临界值质控品2µl,盖好离心管盖,6500rpm离心数秒,使试剂与标本混合。(在二区进行)
2 PCR扩增:将各反应管按顺序放入Roche ,放入仪器中按照该仪器操作程序进行PCR扩增(具体见Roche )。(在第三区进行)
六、结果分析:
Roche :反应结束后自动保存检测数