文档介绍：组织提取DNA方法:(提取方法来自重点室)
,加裂解液500µL,10 ulPK(20mg/L),56℃过夜
2加等体积酚***仿(用手充分摇匀),14000rpm离心30min
3取上清,加等体积***仿,14000rpm,离心15min
4取上清,加等体积异丙醇(预冷),轻摇,14000rpm,4℃离心
5弃上清,75%乙醇洗沉淀,10000离心1min
6自然风干10min,%TE
从血清中提取DNA:(OMEGA试剂盒)
1加样品250µ EP管
2加10µLOB蛋白酶和250µL Buffer µL
Linear Acrylamide ,Vortex 最大速度,15s.
3 孵育10min 65℃.
4 孵育期间短暂vortex
5加260无水乙醇至血清中,vortex 最大速度,
6换亲和柱,将血清上柱,8000g,1min,弃穿流液
7将柱子至2ml 新管,加500µLHB Buffer,8000g,1min,弃穿流液
8将柱子至2ml 新管,加700µL DNA Wash Buffer(已用乙醇稀释),8000g,1min,弃穿流液
9将柱子至新管,加700µL DNA Wash Buffer,8000g,1min,弃穿流液
10将柱子至2ml 新管,15000g,2min,空甩
新管,加50-100µL,65℃预热的Elution Buffer,室温放置5min
12洗脱DNA,8000g,。 新管,重复11-12步。弃柱子,储存溶解的DNA于-20℃
PCR反应条件
94℃ 30`,预变性94℃ 2` 退火温度55℃ 2` 延伸72 30` (35×),72℃ 10min
PCR 体系成分(总体系为20微升)
模板
左引物
右引物
Taq 酶
dNTP
MgCl2
总体系
Buffer
工作液浓度
25uM/ul
25uM/ul
5U/ul
25mM
20微升
10×
加样量
1ul
H-1 KRV
如图:1、2孔加样量为1 ul,3、4孔加样量为2 ul,5、6孔加样量为3 ul,7孔为阴性对照,8孔为空白对照,Maker 大小为2000bp.
(QIAGEN试剂盒)
全血DNA提取
1) 实验前准备: