文档介绍：(1) 学****聚丙烯酰***凝胶电泳原理。
(2) 掌握聚丙烯酰***凝胶垂直板及圆盘电泳的操作技术。
目的要求
聚丙烯酰***凝胶电泳是以聚丙烯酰***凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰***(Acr)和交联剂N,N—甲叉双丙烯聚酰***(Bis)聚合而成。聚丙烯酰***凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。
Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的,但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸***(Ap),催化剂是四***乙二***(TEMED);光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸***,在紫外光照射下引发自由基团。
实验原理
聚丙烯酰***凝胶电泳的凝胶体系有连续和不连续电泳之分。不连续电泳系统由浓缩胶和分离胶两种胶体组成,两种胶体分别由不同的pH 的缓冲液和胶贮液配制而成,形成孔径不同的两种胶体。不连续电泳系统电泳分离过程中包括三种物理效应,即样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和凝胶的分子筛效应。
本次试验采用不连续电泳系统PAGE,通过三种效应将血清中各蛋白质组分按其分子大小、电荷多少不同进行分离。
聚丙烯酰***凝胶电泳有圆盘电泳和垂直板电泳之分,但两者的原理完全相同,只是所用的电泳槽不同。
由于时间问题,本次试验将分两组进行,一组使用圆盘,一组使用垂直板。
夹心式垂直板电泳槽,圆盘电泳槽,电泳仪,直流稳压电源,玻璃板(13×13),注射器及微量注射器
抽气泵,干燥器,培养皿,玻璃棒,吸量管,烧杯,滴管,玻璃管,薄膜手套,滤纸,日光灯
实验仪器
制备分离胶、浓缩胶有关试剂:
凝胶缓冲液,分离胶贮存液,%过硫酸铵;
浓缩胶缓冲液,浓缩胶贮存液,40%蔗糖溶液,核黄素。
Tris-甘氨酸电极缓冲液()
已加入溴酚蓝指示剂的血清样品
染色液(氨基黑)
1%琼脂(糖)溶液
脱色液(7%乙酸溶液)由学生自己配制
实验试剂
一、垂直板聚丙烯酰***凝胶电泳
:
(1)安装夹心式电泳槽
将长短玻璃板分别插到U形硅橡框的凹形槽中(注意勿用手接触灌胶面的玻璃),在长玻璃板下端与硅胶橡框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖且两玻璃板内下端处处有琼脂糖(其目的是封住空隙,凝固后的琼脂中应避免有气泡),琼脂凝固后,将硅胶橡框装入电泳槽内,以对角线的方式将螺丝帽旋紧。
实验步骤
试剂名称
用量(ml)
分离胶缓冲液()
分离胶凝胶贮液
蒸馏水
将以上三种试剂混合均匀后,置于真空干燥器中
抽气10min
过硫酸铵,置于真空干燥器中,抽气10min
(2)分离胶的制备
按上表格配胶,二者抽气后混合均匀,小心不要在溶液中搅出气泡,以免过多接触空气。
迅速用滴管将混合后的分离胶装在二块玻璃板之间至短板上端约3-4cm,并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶形成时有一水平面,(注意加水时,不要引起胶面的大波动)。
在室温中放置,当两界面出现不同折射率时表明已凝胶,时间大约40 分钟,以出现折射率不同的界面为准,再室温下放置十分钟,使凝胶充分。
将分离胶上层的水倒去,再用滤纸吸去多余的水(注意不要碰破胶面),为下一步做准备。
试剂名称
用量(ml)
浓缩胶缓冲液()
浓缩胶贮液
40%蔗糖
将以上三种试剂混合均匀后,置于真空干燥器中,
抽气10min
核黄素
(3)浓缩胶制备: