文档介绍：胰高血糖素样肽素
摘要: 目的研究胰高血糖素样肽素-1( glucogon like peptide-1,GLP-1) 对晚期糖基化终产物( advanced glycation endproducts,AGEs) 诱导 H9C2 心肌细胞凋亡的保护作用机制。方法体外培养 H9C2 细胞,实验分为 4 组: 正常对照组、100 mg L- 1AGEs 试验组、AGEs ( 100 mg L- 1) + GLP-1( 10 nmolL- 1) 组、AGEs( 100 mgL- 1) + NAC( 5 mmolL- 1) 组,处理 24 -8 比色法检测细胞存活率,相差显微镜观察细胞形态,双***荧光素( DCFH-DA) 染色荧光显微镜摄片观察细胞内活性氧( ROS) 水平; RT-PCR 法测定Bax、Bcl-2 mRNA 基因的表达; 运用 Hoechst 33258 检测试剂盒及流式细胞术检测心肌细胞的凋亡率,EM-F12 培养基(Hyclone 公司,美国) ,胎牛血清( BI 公司,以色列) ,GLP-1( Sigma 公司,美国) ,Hoechst 33258 试剂盒购自南京建成生物工程研究所,N-acety-L-cysteine(NAC) 、活性氧检测试剂盒、K-8 试剂盒均购于碧云天生物技术研究所,细胞凋亡检测试剂盒 AnnexinV-FITC/PIKit ( 北京庄盟) ,兔抗老鼠GAPDH( 10494-1-AP,Peprotech 公司产品,美国) ,Bax、Bcl-2( 12789-1-AP) 多克隆抗体为 Peprotech 公司产品,CDI-165M 三气细胞培养箱、BIO-BEST200E凝胶成像系统( SIM 公司) ,TS100-F 倒置相差显微镜( Nikon 公司,日本) ,超净工作台( 苏州净化设备有限公司) ,冷冻高速离心机( 珠海黑马医学仪器有限公司) ,水平电泳仪( 北京六一仪器厂) ,PCR 仪( BIO-RAD 公司) ,BDFACSCalibur 流式细胞仪( BD公司,美国)。
1. 2 方法。
1. 2. 1 细胞培养与处理 H9C2 细胞培养于含体积分数为 0. 15 胎牛血清的 DMEM-F12 培养液,37 ℃、CO2体积分数 0. 05、饱和湿度条件下培养。细胞贴壁 80% 以上时,0. 25% 胰酶消化、计数、传代,每 3 ~4 d 传代 1 次。取接种对数生长期细胞进行实验。
1. 2. K-8 法检测细胞成活率取对数生长期细胞,以2 107L- 1细胞浓度接种96 孔板,各实验组设 4 个复孔,另设无细胞培养液孔为空白对照。K-8 试剂盒说明书,处理结束后每孔加入10μK-8 工作液。37 ℃培养 2 h,酶标仪( El 800,BioTek,USA) 记录 450 nm 波长处的吸光度。取 4 孔光密度( optical density,OD) 的平均值,按下列公式计算细胞存活率: 生存率/% = ( OD 处理组-OD 空白组) /( OD 对照组- OD 空白组) 100% .实验重复 3 次。
1. 2. 3 细胞内 ROS 水平的测定根据实验需要给予相应的处理: ( 1) 实验对照组; ( 2) 100 mgL- 1AGEs