文档介绍：葡聚糖凝胶柱的使用方法:
(1) 预处理
称取Sephadex G-25(50-100目)约5g,加入蒸馏水100ml,置室温下3h进行溶胀。
(2) 装柱
凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧,用洗净的玻璃丝(约200目尼龙布)垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好,先加入1/3柱体积蒸馏水,接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入,使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀,不能有气泡或明显条纹。否则,必须到出重装,装好后,用蒸馏水平衡2-3h即可加样品分离。
(3) 加样
加样前,首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出,直到柱内液面与凝胶表面相齐(或留一极薄液层)为止。然后,由柱的上端加水解液2ml,注意不要让溶液把凝胶冲松浮起,加完样品后,打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐,再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2-3次,待全部进入层析柱后,即可进行洗脱。
(4) 洗脱与收集
洗脱时,用蒸馏水作洗脱剂,并且要连续不断地进行,使凝胶柱上端保持一定的液层,防止凝胶柱表面的液体流干。-。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集,每管收集3ml,共收集10管。据经验,4或5号管核苷酸浓度最大,可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异,管号会有变化,必要时可用紫外检测A260nm,找出浓度最大的管号。
(5) 凝胶的再生和回收
凝胶柱使用一次后,必须反冲疏松一次,平衡后再使用。若使用数次,就需要再生处理。 NaOH- NaCl溶液浸泡,然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕,将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干,再用95%乙醇洗两次,在60℃烘箱中烘干,回收保存。
实验五. 葡聚糖凝胶层析
【实验目的】
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【实验原理】
凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤,是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术,这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒,目前应用较广的是:具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1,2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制,交联度越大,网孔结构越紧密;交联度越小,网孔结构就越疏松,网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析,是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱,各个组分由于分子量不相同,在凝胶柱上受到的阻滞作用不同,而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻,不能进入凝胶颗粒内部,阻滞作用小,随着溶剂在凝胶颗粒之间流动,因此流程短,而先流出层析柱;分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内,阻滞作用大,流程延长,而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间,则在两者之间从柱中流出,由此就可以达到分离目的。