文档介绍：DNA 的限制性内切酶酶切分析
实验十二
限制性内切酶(Restriction Endonuclease,RE):
由细菌自身产生,能识别双链DNA分子中特定的碱基顺序,以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键,产生粘性末端或平头末端
实验原理
EcoR I的作用模式图:
产生5 突出粘性末端
**********GAATTC********
**********CTTAAG********
5
3
5
3
EcoR I
********G
********CTTAA
5
3
-OH
-
P
-AATTC*******
G*******
3
5
P
OH-
5
5
EcoR I
Bcl-2 ()
pBS ()
pBS-Bcl-2 ()
Bcl-2重组质粒的酶切模式图
: 20μl反应体系
组分加入体积
灭菌双蒸水 5μl
10×buffer H 2μl
质粒DNA 10μl
20U/μl EcoRI 3μl
操作步骤(改动)
盖紧盖,掌型离心机混匀,37℃水浴反应1h
在做酶切之前,一定要将上次的质粒DNA沉淀溶解完全之后,再做今天的实验!!!
:胶冷却至60℃左右(不烫手),加入核酸染料5μl ,混匀,将胶缓缓倒入电泳槽(先胶布封口,放好梳子)。
(%):,加入1×TAE缓冲液60ml,微波炉加热中火,2min,摇匀,至无颗粒。(每班叫一位同学制胶)
DNA Marker
已酶切质粒
未酶切质粒
750bp
500bp
100bp
kb
点样孔
250bp
1000bp
2000bp
电泳结果
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁,用掌型离心机离心到底部!
2. 当样品在37℃水浴时,要盖紧盖子,否则水汽进入管内,使反应体积大大增加,造成酶切失败。
,若有需立刻用枪尖吸掉或牙签挑破。