文档介绍：松材线虫��标记与分子检测技术摘要针对松材线虫形态鉴定存在的不足,本文开展了以下四个方面的研究工作:��刹南叱嬗肽馑刹南叱娴腞��觳饧际醯难芯浚��松材线虫与拟松材线虫的��分子标记;��刹南叱嬗肽馑刹南叱婧颂翘寤�����限制性片断长度多态性研究;��刹南叱婵焖偌觳馐约梁械墓菇ā�实验所用线虫样本共�个。其中�个松材线虫株系分别来自于美国、加拿大、中国、日本,��瞿馑刹南叱嬷晗捣直鹄醋匀毡尽⒑ü�⒅泄�约爸泄�台湾地区,�鱿叱嫖炊ㄖ址掷胱晕夜�饕K闪址植记�目菟浪墒鳌�实验取得如下研究结果:�⒋罅肯叱婊�蜃镈�的提取采用裂解法直接提取,不需要研磨,减少��乃鹗АK�崛〉腄�质量较好,���疧��值在��—��之间,样本���吭��一��⒖耍�辽�I倭肯叱娌捎们懈罘ㄌ崛。�叱婢�旱4�����蛞��娲����或一�℃处理�����芄焕┰龀銎状��通过��技术,从��鏊婊��镏猩秆〕�个特异性随枫引物������、������、������和����怖┰龀��鎏�异片段,其中�鏊刹南叱嫣匾炱�危�个拟松材线虫特异片段。���颫�����K刹南叱嬷晗堤匾煲�铮琌��扩增特异片段长约���篛��扩增出两条特异片段长度分别为���、���左右。���颫��、�������K刹南叱嬷晗涤肽馑刹南叱嬷晗倒灿械奶匾煲�铩���扩增出两条松材线虫特异片段分别为������左右,扩增出一条拟松材线虫特异片段长约���籓��扩增松材线虫特异片段长约���,扩增拟松材线虫特异片段长约���;���┰鏊刹南叱嫣匾炱�纬ぴ���,扩增拟松材线虫特异片段长约�����弓�颫������为拟松材线虫株系特异引物,�┰鎏匾炱�纬ぴ���,���┰鎏匾炱�纬ぴ����J笛楸砻鳎�这些随机引物具有特异性强、灵敏度高的优点。七个引物均可以区分松材线虫和拟松材线虫。�⒔�刹南叱嬗肽馑刹南叱鍾��匾炱�微貽�】�����②������ⅱ酧���籑��ⅱ躉��—���、⑤�����、⑨����⑦���籜��、⑧�����、⑨���甔���蟹掷搿⒒厥铡⒂朐靥錺������连接,转化大肠杆菌、培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用���.�软件设计引物。�鎏匾焖婊��沃校��个成功转化为��标记。其中����ü��锒訩��/�勺;�猄��狵�.��,通过引物对���疪可转化为��—��籜����K刹南叱鍿��昙牵��通过引物对���,�可转化为��—��籜���ü��锒訫��/�可转化为����一�������籜�����
籑��D馑刹南叱鍿��昙牵���—��籜����K刹南叱鍿��昙牵�����籑��通过引物对��/�可转化为��—�】一��,为拟松材线虫��标记;�������ü�引物对��/�勺;�猄���引物对���疪、���疪、���疪����疪的特异性均较强,均可用于松材线虫与拟松材线虫的种间鉴定;���疪�灰擞糜谒刹南叱嬗肽馑刹南叱�的种问鉴定;��/�荒芮�炙刹南叱嬗肽馑刹南叱妗��⒂τ肞�—��技术,分析了松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫��—����纬ざ仍嘉���,拟松材线虫��—��区片段长度约为���。用�窒拗菩阅谇忻付粤街窒叱娴腎�区扩增产物进行酶切,结果表明:����盖兴刹南叱嫒禾寰���礁龀ざ仍��和���的片段。而拟松材线虫均不能被���盖校��所有松材线虫样本均不能被��酶切,而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个������的片段;��用��酶切松材线虫群体,除��不能够被酶切外,其余样本能够产生两条长度分别为�����的谱带。拟松材线虫群体,都能产生三条一致的亮带,长度分别为������、���;���械乃刹南叱嫒禾逵肽馑刹南�虫群体的���┰霾�锞�荒鼙籄��盖校����酶切松材线虫���为两条大小分别为������的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为������的谱带。内切酶������梢杂糜诩觳馑刹南叱嬗肽馑刹南叱妗F涿盖薪峁��两种线虫问有明显不同。在酶切检验时,很容易判读检验结果,便于生产上操作;������灰擞糜诩�ㄋ刹南叱嬗肽馑刹南叱妫籄��荒芮�忠膊荒�鉴别松材线虫与拟松材线虫。�⒉捎靡�锒訩��/�钥菟浪墒髂诜掷氲乃刹南叱妗⒛馑刹南叱妗⑵渌�线虫进行检测,结果表明,所有松材线虫株系均扩增出一条���那逦�⒚�亮的条带。而拟松材线虫、其它线虫均无扩增产物。利用引物对���疪构建了松材线虫检测试剂盒。采用本试剂盒可以在较短时间内对线虫进行鉴定。整个检测过程约需时���J迪至硕运刹南叱娴目焖偌觳饽勘辍2⑶腋檬约梁屑觳饬槊舳却锏狡叻�之一条线虫,实现了对幼虫成功鉴定的日标。检测结果便于判读,检测费用较低,适合于生产上应用。关键词:松材线虫;拟松材线虫;��;特异片段;��标记;核糖体基因;限制性片段长度多态