文档介绍：PCR杂交梳法检测淋病双球菌
 
    淋病是由淋病双球菌亦称淋病奈瑟菌所引起的急性或慢性泌尿***系统的化脓性感染。主要通过性接触传染,女性也可由淋球菌污染的衣裤、浴巾、马桶等感染而发生淋菌性***炎。常见检测方法为PCR杂交梳法检测淋球菌DNA。
    [测定方法]  PCR杂交梳法
    [方法学原理]  采用碱变性法对疑为淋球菌感染患者的生殖道分泌物或其他可疑样本进行处理,释放并提取其中的DNA。采用生物素标记引物对DNA进行扩增,用琼脂糖凝胶电泳或杂交方法对扩增产物进行检测。
    [标本准备]
      将高压灭菌的特制棉拭子伸人男性尿道口或女性宫颈口上1~2cm,旋转1周,停留约10s后取出,将棉拭子头放人盛有lml无菌生理盐水的标本冷冻保存管中,从颈部剪断拭子,使拭子头浸入盐水中,反复漂洗。
      取lml初段尿,在无菌离心管中15 000rpm离心15min,弃上清液。
    [试剂]
   
   
      DNA聚合酶
   
    [仪器]  PCR扩增仪
    [检测步骤]
    、初段尿标本、阴性对照,15 000rpm离心10min,弃上清液。沉淀中加入50u1 DNA提取液,使沉淀悬浮后100℃沸水浴15min,15 000rpm离心10min。处理后的样品应在1h内使用,或在-20~-80℃最长保存2周(不宜反复冻融)。
    PCR反应液nX23ul、Taq酶nX 2ul混于一离心管中,用移液器混匀,按每管25u1分装。(若不使用PCR仪的热盖功能,每管加入1滴石蜡油,防止管内液体的挥发)。
    (冻存样品使用前在室温环境中融化,12 000rpm离心2min),试剂盒NG阳性对照(无需处理,可低速离心,剧烈振荡混匀),先低速离心后用振荡器混匀,各取5u!分别加入反应管中,混匀,标记后12 000rpm离心10s,立即进行PCR扩增反应。
    4。将反应管置于PCR仪上,先在37℃环境中反应10min,然后在94℃环境中保温5min,再按93℃45s—55℃45s—72℃60s循环35次,最后在72℃环境中延伸5min。PCR反应结束后应在1h内进行检测;或将PCR反应管一20℃保存,3d内进行检测。