文档介绍：第七章、酶联免疫吸附分析 (Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)
酶联免疫吸附分析法(ELISA)是六十年代出现的免疫测定技术,当时主要用于临床诊断上用于检测药物、蛋白和病毒,经过三十多年的不断改进与完善,已成为一种不可替代的普遍运用的分析方法。
抗原(Ag,Antigen):是一种能够刺激机体的免疫系统发生应答,产生抗体或致敏淋巴细胞,并能在体内或体外与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质。
抗体(Ab,Antibodies):是抗原引起的免疫应答产物之一,可与引发的抗原发生特异性结合,是一类糖蛋白,人血清中的抗体有免疫球蛋白IgG1-4,IgE。
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ELISA其基本原理是在合适的载体上,酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原抗体复合物,在酶底物参与下,复合物上的酶催化底物使其水解,氧化或还原成为另一种带色物质。由于在一定条件下,酶降解底物和呈现色泽是成正比的,因此可以用分光光度计进行测定,从而可以计算出参与反应的抗原和抗体的含量。ELISA检测法核心反应是抗原抗体反应。
ELISA法由于其快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备,且对样品纯度要求不高,特别适用于大批量样品的检测。
ELISA基本原理
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酶联免疫吸附分析的基本原理及特点
酶联免疫吸附分析是把抗原抗体免疫反应和酶的高效催化作用原理有机结合起来的一种检测技术。该技术主要的依据有三点:
(1)抗原(抗体)能结合到固相载体的表面,仍具有其免疫活性。
(2)抗原(抗体)与酶结合形成的酶标结合物,既保留其免疫活性又保留其酶的活性。
(3)结合物与相应的抗原(抗体)反应后,结合的酶仍能催化底物生成有色物质,而颜色的深浅可定量抗原(抗体)的含量,有色产物的量与标本中受检物质的量直接相关。
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第七章、酶联免疫吸附分析 (Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)
酶联免疫吸附分析法主要有三种:
竞争法、间接法、双抗体夹心法、
 
测定在含96孔的平板上进行,所以允许可对标样和大量的样品进行反复试验,整个程序包括分光光度法测定,容易自动化,能迅速分析大量样品。
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MK3全自动酶标仪
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竞争性ELISA技术
特异性抗体吸附于固相上(如一个小塑料盘上),酶标抗原和未标记抗原与抗体培养,然后洗涤;加入酶测定底物,测定酶活。酶活值的大小取决于原始混合物中有多少未标记抗原的数量,所存在的未标记抗原越多,结合于吸附抗体上的酶活越少,反之越多。
在已知数量未酶标记抗原存在下,酶标抗原仍能与抗体结合,与未酶标抗原竞争性与抗体结合。
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(直接)竞争性ELISA技术
抗体
固相表面
酶标抗原
 
抗原
 参考(工作)曲线:制备与抗体有关的酶量与未标记抗原的浓度关系曲线,未标记抗原浓度越高,酶活越低,然后用于测定样品中的抗原数量。
该法的主要缺点:需制备酶与每个抗原的偶联。
对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。
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双抗体ELISA技术(夹心ELISA技术)
特异性抗体吸附在固相上(固定化抗体I),加入抗原,抗原与抗体(抗体I)结合,洗涤后,加入酶标记抗体(抗体II),与抗原结合,加入酶测定底物,在标准条件下测定酶活。
固定化抗体I和酶标记的抗体II,均可与相同的抗原结合,测定连接于复合物上的酶量,酶活与结合抗原数量直接成正比。
参考曲线的制备:特异性抗体吸附在固相上,加入已知数量的抗原,抗原与抗体(抗体I)结合,加入酶标记抗体(抗体II),与抗原结合,加入酶测定底物,在标准条件下测定酶活,抗原数量与酶活成正比,抗原数量越多,酶活越高。
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抗体I
加入抗原
加入酶标抗体II,与抗原接合
抗体特异性结合于固相表面
抗原与抗体结合
加入酶作用的底物,在标准条件下测定酶活,酶活与结合抗原数量成正比。底物的降解量=抗原量
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夹心ELISA技术的实验过程
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