文档介绍：Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:
一、原理
二、分类
三、主要试剂
四、主要步骤
五、实验常见的问题指南
、胶和膜的问题
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰***凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如***纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类
western显色的方法主要有以下几种:
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。 
三、主要试剂
1、丙烯酰***和N,N’-亚甲双丙烯酰***,应以温热(以利于溶解双丙稀酰***)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰***和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰***储存液丙稀酰***29g,N,N-亚甲叉双丙稀酰***1g,加H2O至100ml。)储于棕色瓶,4℃避光保存。,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉淀,可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v),1mlH2O去离子水配制,室温保存。
3、分离胶缓冲液:-HCL():,加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。
4、浓缩胶缓冲液:-HCL():,用约48ml 1mol/L 。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备,再用HCL调节PH值,。
5、TEMED原溶液N,N,N’N’四***乙二***催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰***的聚合。PH太低时,聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸***溶液。提供两种丙稀酰***聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml,临用前配制.
6、SDS-PAGE加样缓冲液: Tris缓冲液8ml,,10%SDS ,,%,H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合,在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20-25ul,总蛋白量100μg。
7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:,188g甘氨酸,10gSDS,用蒸馏水溶解至1000ml, Tris-。临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液:配制1L转移缓冲液,、、 SDS,并加入200ml甲醇,加水至总量1L。
9、丽春红染液储存液:丽春红S 2g 三***乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v)。
11、NaN3 % 叠氮钠(有毒,戴手套操作),溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(),500mmol/LnaCl。
13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、过氧化物酶标记的第二抗体。
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