文档介绍：第三军医大学
硕士学位论文
分枝杆菌Ag85B的原核表达及其多克隆抗体的制备
姓名:张勇
申请学位级别:硕士
专业:外科学(泌尿外)
指导教师:靳风烁
20040401
第三军医大学硕士学位论文
分枝杆菌 Ag85B 的原核表达及其多克隆抗体的制备

摘要

一目的
BCG 膀胱灌注是治疗膀胱肿瘤防止其复发的最有效方法之一但目前在治疗中存
在着给药量大疗效不确切易导致结核播散等并发症提示着必须对这一方法进行
改造 Ag85B 是结核杆菌的主要分泌蛋白之一是结核杆菌的主要保护性抗原 Ag85B
基因的发现为膀胱肿瘤的治疗提供了一条新的线索利用分枝杆菌 Ag85B 的免疫原
性在膀胱癌及其它肿瘤治疗中的应用研究近年来受到重视本科室正利用 Ag85B 基
因对膀胱肿瘤的治疗进行进一步的研究希望找到一种治疗膀胱肿瘤的新的有效方法
本实验的目的是制备兔抗 Ag85B 多克隆抗体, 为相关的研究提供实验室素材用来鉴
定融合蛋白内或组织里的 Ag85B 蛋白
二研究内容及结果
本研究中首先构建编码结核分枝杆菌 Ag85B 分泌蛋白的重组表达质粒将此质粒
转入大肠杆菌诱导表达融合蛋白并加以纯化然后将纯化的蛋白免疫家兔提取家
兔的抗体血清纯化制备多克隆抗体并进行鉴定主要研究内容和结果如下
1 用 EcoRI 和 SalI 双酶切从 pUC18-Ag85B 质粒上切下 Ag85B 基因片段然
后将该片段插入经过同样双酶切的融合表达载体 pGEX-4T-1 中构建重组
pGEX-Ag85B 质粒酶切鉴定及测序结果表明, 成功构建了原核表达质粒
pGEX-Ag85B
2 将 pGEX-Ag85B 重组质粒转化入大肠杆菌 BL21 重组基因工程大肠杆菌发酵
后用 IPTG 诱导表达 GST-Ag85B 融合蛋白其主要是以包涵体的形式存在洗涤包
涵体进行初步纯化将包涵体进行变性和缓慢稀释复性用 Sepharose High Performance
离子柱分离纯化 SDS-PAGE 电泳分析该蛋白纯度达到了 95%以上
3 将纯化的 GST-Ag85B 融合蛋白作为抗原,在与佐剂乳化后,免疫家兔共 4 次,抽
取家兔的抗血清用盐析法粗提 IgG 多克隆抗体,离子交换法进一步纯化抗体酶联免
疫测定法 ELISA 鉴定抗体证明制备的多克隆抗体可以与 GST-Ag85B 融合蛋白
相结合产生抗原-抗体反应
4 利用 Ag85B 多克隆抗体对本科室制备的 Ag85B/IL-2 融合蛋白进行鉴定
V
第三军医大学硕士学位论文
Western-blot 结果证实所制备的多克隆抗体可有效识别原核细胞表达的 Ag85B/IL-2 融
合蛋白
三结论
成功制备了 Ag85B 多克隆抗体初步应用效果满意,为 Ag85B 与膀胱肿瘤的研究
提供了重要的实验室素材为进一步的研究奠定了基础

关键词多克隆抗体; Ag85B ; 膀胱肿瘤融合蛋白
VI
第三军医大学硕士学位论文

Prokaryotic Expression of Mycobacterium antigen 85B
and the Preparation of polyclonal Antibody

Abstract

1. Objective
Intravesical instillation of BCG is one of the most effective treatment and recurrence
prevention approach of bladder cancer. However, as the BCG dose are large and
Incertitude of curative effect, so this therapy is associated with plications such as
disseminated mycobacteriosis disease,which suggesting that this treatment must be
improved. antigen 85B (Ag85B) is one gene of the mycobacterium secreted protein, which
is primary antigen of mycobacterium tuberculosis. It provide a new way for the theament of
bladder cancer. Our depar