文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
人源性纤溶酶原Kringle5的基础和实验研究
姓名:尹桂芝
申请学位级别:博士
专业:内科学(心血管)
指导教师:于金德
20040501
人源性纤溶酶原幕『褪笛檠芯中文摘要目的与背景冠心病是威胁人类健康和生命的首要病因,其病理基础主要为动脉粥样硬化,因此延缓动脉粥样硬化的发生发展是防治冠心病的根本途径。研究表明动脉粥样硬化斑块内新生血管能加重慢性炎症反应和脂质沉积,促进病程进展,导致斑块不稳定,抗血管新生有望成为防治动脉粥样硬化的有效措施。纤溶酶原窍巳苊冈牧呀馄危哂刑匾煨砸种颇谄は赴鲋场迁移的作用,分子量小,免疫原性低、生物活性高,是很有应用前景的血管形成抑制因子,目前国内外对的研究较少,对动脉粥样硬化的影响尚未见报道。基因治疗相对而言优于重组蛋白质治疗,杆状病毒作为基因治疗载体的研究刚刚起步,其具有安全、高效、制备简单等优势,是很有希望的基因治疗载体。因此,我们克隆了人源性纤溶酶原区基因,并表达纯化重组蛋白,鉴定其生物活性,探讨其血流动力学特点及组织分布。构建重组杆状病毒载体,制备病毒,以肠杆菌,以诱导表达重组蛋白,经髦缀筒阄鼋写炕定放化纯度,竞争结合试验观察“;猺阅谄は赴鸈慕岷献饔茫琷Ⅵ痥ゼ亮课簿猜鲎⑸洹猺装制备病毒狵虰—灾刈椴《咎逋飧腥炯≡葱韵赴鸆后通过荧检测细胞内和上清中的。检测注射部位骨骼肌和血清中的,鸡胚绒毛尿囊膜实验检测活性。采用髂动脉内膜剥脱术后高脂饲养的方法建立兔动脉粥样硬化模型,只雄性新西兰大自兔随机分为对照组和治疗组诓煌逼谟胓—干预恐苋⊙,芎蠼绪亩鲅9造影,取材,血管常规染色切片用图像分析系统计算血管内膜面积、中膜面杆状病毒为载体进行防治动脉粥样硬化的初步研究。方法:肞方法扩增出基因,克隆进原核表达载体;管内皮细胞增殖抑制实验鉴定活性。訧ㄖ聘鳌卜,法测法检测“—的生物活性。大鼠痥亮烤簿猜龈不同日嗳⊙2夥派湫约剖绦蚰夂虾蠓治鲆┐ρР问B闶は陆又諥伟┫赴周后,按于不同时相采血,取组织,测放射性计数,分析“—在裸鼠体内的组织分布。菇ㄖ刈镵置谛透俗床《驹靥澹訠——俗床《颈泶锵低嘲光显微镜检测报告基因谋泶铮ü∪庾⑸涫剐挛骼即蟀淄酶腥綛—,上海第二医科大学博士学位论文
积、空腔面积及最大内膜厚度。采用硝酸还原酶法测定血清浓度,放射免疫剂量给药后选择二室模型拟合药时曲线,分布相半衰期一。,:璓成功扩增出腒颍庑蛘泛罂寺∥猵一狵在中表达出特异性蛋白,纯化后的蛋白纯度达%,具有剂量依赖性抑制内皮细胞增殖的作用。猺谋昙锹蚀笥ィ呕慷却笥后放化纯度仍大于%。竞争结合试验显示随未标记剂量递增,”—结合内皮细胞的例递减,匝橄允尽猺种颇谄は赴清除相半衰期,!为.±,.±./妗Fは陆种鯝赴周后移植瘤的直径可至,成瘤率ィ猺经单剂量静脉注射后,在甲状腺、觥⑽浮⒏蔚茸橹呱闳。琢黾∪,病毒滴度大于痬珺~腥检测到特异性条带。瓸—腥拘挛骼即蟀淄霉趋兰『天即能检测到沙中泶周。实验兔肌肉注射狵笤诩∪庾橹把G逯芯测到特异性蛋白条带,含有的血清能抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成。动脉粥样硬化模型建立成功,血管造影结果表明早期治疗组髂动脉狭窄程度比对照组轻,血管组织切片图象分析显示与对照组相比,狵瘟谱榈难结论:】.克隆构建的人源性纤溶酶原具有特异性抑制内皮细胞增殖的活性。甀ㄖ票浮猺拇慷雀撸榷ㄐ院茫锘钚杂胛幢昙荎恢隆单剂量给药后在大鼠体内的半衰期约为小时,”—能在新生血管密集部位积聚。瓸一芨腥咎逋馀嘌募∠赴托挛骼即蟀淄霉趋兰∽橹竦的分泌性表达,重组蛋白具有活性。早期狪干预能延缓动脉粥样硬化发展,有利于/维持平衡状态。狵允笛橥冒踩ā人源性纤溶酶原新生血管血流动力学动脉粥样硬化增殖作用与未标记无显著差异.。“猺痥簿猜龅时间延长逐渐增高,.,.±肌细胞小时后检测到绿色荧光蛋白高表达,感染狵募∠赴吧锨逯芯管空腔面积较大,内膜面积小,最大内膜厚度降低。/狵瘟谱樵诟┖周和苁毖G錘ǘ壬仙=珽水平下降。实验前后各组实验兔的肝肾功能均在正常范围。关键词杆状病毒基因治疗%,上海第二医科大学博士学位论文
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血管新生是指从已经成型的血管上形成新的毛细血管的过程,生理情况下其与胚胎发育、伤口愈合等相关。它受血管诱导因