文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
利用转基因和基因剔除技术研究KIF18A和Adiponectin基因功能
姓名:任维华
申请学位级别:博士
专业:分子遗传学
指导教师:王铸钢
20050501
隰溯函作者签名:幽主垒嗍聱学位论文使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行盼研究工作及取得的研究和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本趣定。成果。据我所知,除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中作了明确说明并表示谢意。本人完全了解上海第二医科大学有关保留、使用学位论文的规定,学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机梅送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题,,..导师签名;
中文摘要疾病发病机制和药物筛选等进行研究,已成为现代生物学各个研究领域最重要的技术手段之一。本研究通过对;蛐∈笞;虿迦胛坏憬屑ǎ状畏⑾肿;虿迦小鼠湃旧寤蜃楹螅餕蛉笔В⑾指没蛉笔У贾滦坌孕∈蟛挥并对其可能的机制进行了研究;利用同源重组技术构建成功全基因打靶质粒并获通过向受精卵导入外源转基因蛄泻螅;蛐蛄锌赡芩婊牟迦胄∈蠡蜃的任意位置,其中约%的转基因插入位点位于小鼠的一个内源性基因内,导致这些基因插入突变分离有趣表型相关新基因共对其功能进行进一步研究不失为一种有效的方我们在以往研究癌基因;蛐∈蟮墓讨胁⑽捶⑾中∈蟪鱿衷て诒硇停迥亦未检测到转基因的表达。在转基因小鼠繁育的过程中发现鲎;蚱废抵杏幸幌系坌孕∈蠓⑸挥⒇和栉酢⒕尤狈ΑS谑嵌愿米;蛐∈笙底;虿迦胛坏憬利用多种生物信息学数据库软件对湃旧两侧各延长姆段Ы利用小鼠转基因和基因剔除技术,从整体动物水平对未知基因功能、胚胎发育、人类得了同源重组细胞克隆。基因的断裂或缺失而表达丧失或表型异常。这种情况下,转基因作为断裂或缺失基因的分子标记物,为区分突变性表型缺陷和潜在的遗传性缺陷提供了一种直接的方法。所以用转鉴定。确证该的转基因序列插入小鼠湃旧澹⒁。行扫描分析发现,小鼠湃旧缺失片段主要引起动力蛋白超家族新成员、两种转录本的缺失。为细胞内动力蛋白易宓男鲁稍保∈驥蛭挥谛∈S肴薑蛴サ耐葱裕鞍字市蛄杏サ耐葱浴R训锹焦ú嫉男法。上海第二医科大学博士学位论文
序列中,有四个完整的转录本,其序列号分别为,蛋白质序列,命名为、、、。由个嗦耄渌来斡芍饕M贏都没有核定位信号。;虿迦肴笔Х⑸洌斐葾街转录本鯡和鯡娜笔А8没蛭P碌墓δ芪粗;颉根据转基因及其邻接的基因组序列,以转基因序列为探针,通过杂交的转基因序列是以两个拷贝串联,单位点插入小鼠湃旧宓摹序列为探针,对各周龄野生型、突变小鼠睾丸长和特异短片段半定量发现,芰浼耙陨现芰湟吧托∈蟪鱿重和杼匾毂泶锏管壁变薄,各级生精细胞明显减少。芰涫保槐浯亢闲∈筘和枨妇ü苌掀ぜ,,分别转录表达由霭被槌伞、末端非翻译区序列稍不同的前嗦耄庑┳B急椒ǘ宰;,结合对三种基因型小鼠睾丸不同转录本全新转录本,该转录本大小约谧;虿迦牒笥階B急就狈⑸失。突变纯合小鼠在以上转录本缺失后引起转录本在睾丸、胸腺和脾脏组织蛄形L秸耄酝槐浯亢闲∈蟀ㄍ僖合佟⒙殉埠拓和璧茸橹进行转基因表达检测分析,证明该转基因插入基因组后不表达或表达沉默。说明突变纯合雄性小鼠不育表型与转基因本身功能无关。解剖形态学观察发现,芰湟陨贤槐浯亢闲∈筘和杼寤椭亓棵飨员湫。猿墒焓对小鼠睾丸和附睾常规组织病理切片分析及三色原位荧光杂交显示,初生突变纯合小鼠睾丸曲细精管与野生型和杂合小鼠小鼠睾丸曲细精管没有明显差异,但在发育到芰浼耙院螅孀拍炅涞脑龀ぃ槐浯亢闲∈笄妇ü芪醪⒃角餮现兀芮槐湫。鼠的⒕及以共有表达明显的上调。以转基因为野生型和杂合小鼠的.。上海第二医科大学博士学位论文
相反,野生型和杂合小鼠睾丸曲细精管管腔大,各级生精细胞形态明确,生精上皮存在明显的周期性循环。关基因表达情况进行检测发现,芰淝巴槐浯亢闲∈筘和鐳错配修复基因不表达或表达很低,芰渫槐浯亢闲∈筘和鐼泶锊徘髡#周龄突变纯合小鼠睾丸才有联会复合体蛋白基因泶铮秃笠吧托∈罅街埽淮窒咂谔匾毂泶锓肿、胚胎干细胞标志分子/在突变纯合小鼠睾丸表达水平低。低表达;两周龄以后突变纯台小鼠睾丸谋泶锼矫飨愿哂都降低,但突变纯合小鼠睾丸三种细胞周期调控分子的表达水平一直高于野生型小鼠睾丸芰銴∈筘和璞泶锔咚娇沟蛲鲆蜃覤酝槐浯亢闲∈筘和鐱表达最高:芰涫蓖槐浯亢闲∈筘和杓负醪槐泶飃周龄各基因型小鼠睾丸间质细胞表达分子标志物在芰湓雍霞按刻ㄐ∈筘和柚校氏置飨缘募量依赖性上调。胞有明显