文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
应用RNAi和反义核酸技术治疗β地中海贫血的基础研究
姓名:谢书阳
申请学位级别:博士
专业:遗传学
指导教师:曾溢滔
20050501
缩略词十二烷基磺酸钠涣姿岣视腿┩亚饷牛血清白蛋白乙二***四乙酸荧光激活细胞分离仪人巨细胞病毒启动子胎儿型血红蛋白信使聚乙二醇血红蛋白英文全称中文全称人红向血病细胞株小干扰览档腞聚合酶般链盏嫉某聊春咸转数/分扇反转录酶溴化乙锭二羟***氨基甲烷简称启动子小鼠红白血病细胞株绿色荧光蛋自聚合酶链反应上海第二医科大学博士学位论文猧
刚胡:篓忌作者签名:镬丝卫旦雩羞荔日期:缋望三一廿刁三￡生竺,学位论文独创性声明学位论文使用授权声明疗日本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中作了明确说明并表示谢意。本人完全了解上海第二医科大学有关保留、使用学位论文的规定,学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。成果。据我所知,除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含其他个人已经有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。、学位论文作者签名日期导师签名寸,,
应用和反义核酸技术治疗刂泻F堆5幕⊙芯中文摘要作用机制的一种良好模型。本课题拟在原来应用反义瘟苝究的基础上,首次设计和构建特异性针对或榈鞍谆虻腞扇旁靥澹首先,我们应用技术抑制报道基因绿色荧光蛋白在细胞水平的榈鞍譵O斐<艚拥榈鞍纂牧吹奈:μ峁┮谰荨W詈螅P托∈蟮钠堆V⒆础猅’堑贾轮泄仄短赜械摹⒁彩亲常见的突变型之一。仄兜闹饕L卣魇浅扇诵脱:斓鞍琣蛋白肽链的合成减少或缺乏,主要发病环节为红细胞内榈鞍纂牧春铣伤堆Q榈鞍壮粱⒕廊斐<艚拥腄珠蛋白肽链、平衡。链/幢壤狟地中海贫血的基因治疗提供理论依据和应用基础。和转基因小鼠个体水平的特异性表达,证明了应用技术在个体水平进行基因治疗的可行性。其次,在细胞水平我们应用技术抑制珠蛋白的表达,为抑制榈鞍壮粱⑵胶鈕/榈鞍缀铣杀壤於ɑ。坏谌ü种埔斐剪接珠蛋白的表达,以及应用特异性表达的反义核酸载体纠正异常剪接个体水平应用质粒载体改善一、抑制红系特异表达的特异性针对的载体构建以巢式椒ù尤伺呱赴锌寺∫览涤赗聚合酶腍舳子,用于驱动蔚暮铣桑⒔獺舳涌寺≈罷载体上,得到对照载体,另外将干扰片段克隆到靥迳希玫皆靥錞扇旁靥。然后,酶切启动子和干扰片段克隆至人细胞复制载体玫皆靥对照载体蚉扇旁靥。将本所构建的能在红系特异表达的载体刂泻F堆简称仄是世界范围内流行的遗传性血液病,上已发现嘀諦地贫突变型,其中榈鞍谆虻内含子第籧—的剪接缺陷型突变一中珠率的不平衡。由于地贫是在琺艚铀揭斐5募膊。士勺魑Q芯开展和反义核酸技术介导基因治疗地贫的基础研究,目的是降低过剩瓻靥功能部分煜邓呈皆<⒑煜堤匾炱舳及克隆到对照载体蚉扇旁靥上,分别得到共表达载体对照载体至今世界上海第二医科大学博上学位论文
我们用和肋酶切表达载体含有启动子玸干扰片为了研究扇旁靥、对表达的沉默作用,我们选择了及赴街窒赴到醒芯俊J紫龋玡靥搴蛃种谱;蛐∈筇迥诤煜堤匾毂泶锏膃为了进一步研究捶裰来瘛秂冢唬苁筇迥诒1泶铮颐墙莝处中表达的动态变化。研究发现,尾静脉注射靥逯埃凶;达,但质粒在细胞内滞留时间是有限的,当细胞内的质粒逐渐消失后笤既后瑂实验小鼠衷达会逐渐回升到原来的水平。为了研究靥进一步研究。研究发现,靥迥茉俅我种谱;蛐∈笱V衑泶铮特异性针对榈白詓载体的构建细胞水平研究干扰载体共转染到和赴校∈焙螅τ糜ü庀晕⒕倒鄄臁制情况,结果发现苡行У厥赴蚆细胞中表达量降低理转基因小鼠,采集转基因小鼠尾静脉血,分析转基因小鼠血小鼠血中表达水平基本稳定一~,每六天检测一次6鴈转基因小鼠经尾静脉注射靥逯螅捎趕的作用,转基因小鼠未受明显影响。这表明柿D芙牍撬柙己煜赴种葡赴趀是否能再次抑制转基因小鼠血中表达,我们选择转基因小鼠持续约两周,而对照鼠泶镂词苊飨杂跋臁二、抑制伍珠蛋白的表达地中海贫血时,由于榈鞍纂牧慈狈Γ筿珠蛋白链相对过多,多余的闯粱墒购煜赴な艿剿鹕耍妆黄苹怠NA思跎賝【珠蛋白沉积的危害,我研究钥谥榈鞍妆泶锏囊种谱饔谩Ⅳ干扰载体流式细胞技术和定量方法分析细胞中詄泶锏囊,,V衑泶锼皆诖∈焙罂J枷陆担庵忠种菩应至少可持续埽械目沙中街芤陨希哉招∈表达们构建特异陛针对局榈鞍譵膕载体,分别在蚄赴约兑陨稀上海第二医科大学博士学位论文
种迫薑细胞榈鞍椎谋泶们将三种特异性针对人。珠蛋白肽链的泶镌靥遄H綤赴辏ü和蛋白水平的检测,研究榈鞍纂牧幢泶锏南喽院浚⒂肊治觥贫患者榈鞍壮粱⑵胶鈇/榈鞍缀铣杀壤耐揪督蠦地贫的治疗