文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
GDF-5在骨骼系统形成过程中的表达及作用机制研究
姓名:吕学敏
申请学位级别:博士
专业:外科学(骨外科)
指导教师:杨庆铭
20040401
诠趋老低承纬晒讨械谋泶锛白饔没蒲芯形恼R方法:正常怀孕小鼠脱颈处死,分别选取孕天至天胚胎肢芽。采用目的:研究肢体骨骼系统发育的形态学演变,探讨、捌渌喙脊椎动物肢体骨骼系统的形成起源于胚胎期中胚层侧板,当胚胎发育到一定时期,侧板中胚层的问充质细胞在将要形成长骨的位置聚集,并不断增殖,突起于胚体。突起部分连同被覆的外胚层共同构成胚胎早期的肢芽结构,肢芽中心的间充质细胞在特定的空间和分化信息调控下,增殖、分化,最终形成成熟的骨骼系统。很多研究表明,骨折愈合、新骨形成和胚胎期骨形成具有很大相似性,都经历了间充质细胞聚集和软骨内骨化过程。研究骨骼系统形成过程中相关的调控机制可以为骨不连、骨缺损的治疗及组织工程化骨的构建提供新的思路和依近年来的研究发现,骨形态发生蛋白易宄稍保し只蜃樱怨枪亟谙低车姆⑸。但对于及相关调节基因在骨骼系统形成过程中的表达及对肢芽细胞增殖和分化的影响机制,目前尚缺乏深入研究。本课题试图研究和另一个在骨骼系统形成中超中枢性调控作用的转录因子涞淖饔霉叵担惫鄄炱渌牡骺匾蜃釉谛∈蠊趋婪育过程中表达的变化情况,初步推测由介导的信号通路对骨骼系统形成的调控,并且采用体外实验方法,较深入地探讨了对肢芽细胞调节基因在骨骼发育过程中表达的变化进行,推测相互之问的关联关系。然后,观察不同浓度对肢芽细胞增殖、分化及形态学特征的影响情况,初步探讨对肢芽细胞软骨分化的影响。并进一步研究对肢芽细胞增殖和分化的影响机制,深入探讨杂跋旃切纬傻闹匾5骺匾蜃泶锏挠跋烨榭觥增殖和分化的影响机制。据。上海第二医科大学博士研究生学位论文中文摘要
结果;.茜素红染色显示,红染区随骨骼发育的进展而扩大,∈蠊趋婪⒂讨行翁П浠扑丬缢睾染色区所占比例随骨骼发育时间不同的变化情况。将肢芽剪碎,使用液裂解细胞,抽提总邪攵縍从Γ觳釭.、表达随发育时间的变化情况。、产物凝胶电泳后纯化回收,将回收克隆到。质粒,质粒经转化、扩增、测序鉴定后,行体外逆转录,合成地高辛标记的探针,对不同时间段的肢芽行原位杂交检测。取孕天小鼠肢芽,消化分离细胞,行肢芽细胞微团培养。给予不同浓度干预细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。。。使用扫描电镜进一步观察不同浓度组对肢芽细胞软骨结节形成的影响。干预旌蟮闹肯赴ü,抽提总蠷┰觯炕厥铮浚瞥杀曜计罚訥为内对照,行扩增,分析对肢芽细胞泶锏挠跋臁中于骨干中部肥大型软骨细胞的聚集处,范围逐渐扩大,由孕天时的%增大至孕天的%。半定量结果提示,、及诠趋婪⒂讨芯顺绦蛐圆ǘ珻谋泶锔叻逋背鱿郑珻表达高峰稍早于出现,二者表达持续时间相似,表达高峰出现时间问于虲籰之间,在关节形成早期出现,孕天后表达量下降,维持于一较低的表达水平。原位杂交结果提示主要在关节区表达,孕天后表达量下降,饕T诠悄ぜ骨化中心两侧表达,随发育时间增加表达范围持续扩大。癈上海第二医科大学博士研究生学位论文中文摘要
结论:趋老低承纬晒淌抵室彩侨砉窍赴鲋场⒎只⒎蚀蟆⒆钪展腔关键词:肢芽————钡耐揪妒迪侄怨呛凸亟谙低承纬傻牡骺亍细胞培养第霨对肢芽细胞大体形态无明显影响,培养第烀飨可见细胞结节的大小和数目增多,细胞量也明显增多。染色显示,,第焓保庖恍вΩ用飨裕诮峤诖笮『统墒於确矫嬉/组效应最显著,呈荆量倚赖模式。,/组的促增殖效应最明显。扫描电镜结果提示,可使肢芽细胞间的连接更为紧密,并促进肢芽细胞软骨分化和软骨结节形成,这一效应同样与的浓度呈正相关。免疫细胞化学提示,对照组和瓹加幸欢康表达,但表达程度较低,可明显促进其表达这种促进作用与的浓度呈正相关,以痬饔米钗O灾促进泶铮ǘ仍礁撸俳饔迷角苛摇过程,在这一过程中,一参与了对软骨细胞增殖和分化的调控,三者之间在作用上具有相互承接性。,作用强弱与细胞暴露的ǘ瘸收喙亍瓽.ü系鰿和泶锏耐揪洞俳肯赴娜砉分化,而促肢芽细胞的增殖和聚集作用可能是通过提高细胞粘附分子狢谋泶锸迪值摹=岷锨笆鲅芯浚醪酵撇釭.ü
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